Show simple item record

Development and Evaluation of Diagnostic Test for Dengue/Leptospirosis/Scrub typhus IgM/IgG Multiplex Antibody Detection

dc.contributor.authorอุไรวรรณ โฆษิตานนท์th_TH
dc.contributor.authorกัลลยานี ดวงฉวีth_TH
dc.contributor.authorธารารัชต์ ธารากุลth_TH
dc.contributor.authorวุฒิกรณ์ รอดความทุกข์th_TH
dc.contributor.authorนภัสวรรณ บุญสาธรth_TH
dc.contributor.authorสุธี ยกส้านth_TH
dc.date.accessioned2017-08-24T08:47:36Z
dc.date.available2017-08-24T08:47:36Z
dc.date.issued2560
dc.identifier.otherhs2350
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11228/4764
dc.description.abstractไข้เฉียบพลัน (acute febrile illness หรือ undiffenerentiated fever) เป็นโรคที่พบบ่อยและเป็นปัญหาในประเทศต่างๆ ทั่วโลกรวมทั้งประเทศไทย อาการสำคัญ คือ ไข้และปวดศีรษะ ซึ่งเป็นอาการที่ไม่จำเพาะและไม่สามารถเจาะจงไปยังโรคหนึ่งโรคใด การวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการจึงมีความสำคัญอย่างยิ่งในการยืนยันการวินิจฉัยอาการทางคลินิก จึงเป็นที่มาของการพัฒนาชุดทดสอบที่สามารถวินิจฉัยโรคโรคสครับไทฟัสและโรคเลปโตสไปโรสิสได้รวดเร็วและถูกต้องแม่นยำ โครงการนี้ได้ผลิตต้นแบบผลิตภัณฑ์สองชิ้น คือ ชุดทดสอบแบบรวดเร็วการตรวจวินิจฉัยโรคสครับไทฟัส ชนิด IgM/IgG และชุดทดสอบแบบรวดเร็วการตรวจวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรสิส ชนิด IgM/IgG โดยวิธี Immunochromatrogaphic based gold nanoparticles test (Strip test) ซึ่งใช้ recombinant proteins เป็นแอนติเจน โดยผลิต recombinant proteins เริ่มด้วยการออกแบบไพร์เมอร์ของยีนที่ควบคุมการสร้างโปรตีนที่ต้องการ สกัดสารพันธุกรรมของเชื้อเพื่อเป็นต้นแบบจำลองยีน ด้วยเทคนิคโพลีเมอร์เรสเชนรีเอกชั่น (PCR) นำไปโคลนเข้ากับพลาสมิด หลังจากนั้นทำการคัดเลือกโคลนที่มีชิ้นส่วนของยีน ด้วยเทคนิค PCR และ restriction fragment analysis จึงได้ recombinant โคลนต่างๆ ที่มีความสามารถสร้างโปรตีน ให้ผลิตโปรตีนแล้วผ่านกระบวนการทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ โปรตีนของโรคสครับไทฟัสและโรคเลปโตสไปโรสิส คือ 56kDa proteins จากเชื้อ Orientia tsutsugamushi สายพันธุ์ (prototype strains) Karp, Kato และ Gilliam และ 25kDa [Electron transfer flavoprotein subunit beta (ETF_beta)] ตามลำดับ ในการพัฒนาชุดทดสอบการวินิจฉัยโรคสครับไทฟัส ได้ recombinant 56 kDa proteins ของทั้งสามสายพันธุ์ มีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่มีความคล้ายคลึงกับลำดับนิวคลีโอไทด์ที่อยู่ใน NCBI database เท่ากับร้อยละ 97.8, 97.7 และ 97.4 ตามลำดับ จากผลการทดสอบ immunoreactivity ชี้ว่า recombinant 56 kDa proteins สามารถใช้เป็นแอนติเจนได้ดีมากในการตรวจหาแอนติบอดีต่อทั้งสามสายพันธุ์ Karp, Kato และ Gilliam รวมทั้งสายพันธุ์ TA716 และ TA763 ได้การประเมินชุดทดสอบโรคสครับไทฟัส ชนิด IgM (Scrub_M) และ ชนิด IgG (Scrub_G) โดยใช้ immunofluorescence assay (IFA) เป็นวิธีมาตรฐาน โดยใช้เกณฑ์การพิจารณาผลบวกจากค่า titer ของ IFA_IgM/IgG (titer > 1:400) กับตัวอย่างตรวจซีรัม จำนวน 318 ตัวอย่าง ประกอบด้วย scrub typhus จำนวน 100 ตัวอย่าง และ non-scrub typhus จำนวน 218 ตัวอย่าง (leptospirosis จำนวน 53 ตัวอย่าง, dengue จำนวน 96 ตัวอย่าง, มิวรีนไทฟัส จำนวน 30 ตัวอย่าง และ โรคไม่ทราบสาเหตุ จำนวน 39 ตัวอย่าง) ค่าการประเมินชุดทดสอบ Scrub_M/G มีความไวร้อยละ 97.0 ความจำเพาะร้อยละ 100 ค่าทำนายผลบวก ร้อยละ 100 และค่าทำนายผลลบ 98.6 หากพิจารณาแยก สำหรับค่าการประเมินชุดทดสอบ Scrub_M มีความไวร้อยละ 81.0 ความจำเพาะร้อยละ100 ค่าทำนายผลบวก ร้อยละ 100 และค่าทำนายผลลบ ร้อยละ 92.0 ค่าการประเมินชุดทดสอบ Scrub_G มีความไวร้อยละ 93.0 ความจำเพาะร้อยละ100 ค่าทำนายผลบวก ร้อยละ 100 และค่าทำนายผลลบ 96.9 การประเมินชุดทดสอบโรคเลปโตสไปโรสิส ซึ่งเตรียมโดยการหยดแอนติเจนเอง (version 1) ชนิด IgM (LepProt_M) ซึ่งมี recombinant ETF protein เป็นแอนติเจน และ LepLPS_M ซึ่งมี LPS เป็นแอนติเจน กับค่า titer ของ IFA ชนิด IgM (IFA_M) ต่อ leptospirosis พบว่าในกลุ่มผลลบของ IFA_M (titer <1:50) ได้ผลลบตรงกันด้วย LepProt_M และ LepLPS_M คิดเป็นร้อยละ 43.5 สำหรับในกลุ่มผลบวกของ IFA_M titer 1:400 ถึง > 1:6400 ได้ผลบวกตรงกันด้วย LepProt_M คิดเป็นร้อยละ 44.4 (4 ใน 9 ตัวอย่าง) ตามลำดับ สำหรับ LepLPS_M ได้ผลบวกทุกตัวอย่าง สำหรับ LepProt_M และ LepProt_G ยังได้ผลไม่ดีนักแสดงว่าการตรวจหาแอนติบอดียังไม่ดีพอ สมควรที่จะปรับปรุงแก้ไข เช่น บัปเฟอร์ เมมเบรน และ conjugate เป็นต้น เมื่อทราบปัญหาจึงได้พัฒนาจนกระทั่งได้แอนติเจนที่ดีใช้ใน strip test เมื่อวิเคราะห์ผลของ LepLPS_M ได้ผลบวกเกือบทุกตัวอย่าง อาจเป็นไปได้ว่ามีความไวสูงมากหรือมีปัญหาของผลบวกปลอม จำเป็นต้องมีการทดสอบต่อไป ต่อมาได้มีการพัฒนา LepProt_M และ LepProt_G เป็น version 2 ในการประเมินชุดทดสอบ เทียบกับชุดทดสอบที่มีวางจำหน่าย SD BIOLINE Leptospira IgM/IgG (SD Lep_M/G) ซึ่งมีความไวร้อยละ 96.2 และความจำเพาะร้อยละ 95.7 จากการศึกษาพบว่า ไม่สามารถใช้ผลการแยกเชื้อเป็นวิธีมาตรฐาน อย่างไรก็ตามหากใช้ผลการแยกเชื้อเป็นวิธีมาตรฐาน พบว่า LepProt_M มีความไวสูงกว่า SD Lep_M ในด้านการตรวจหาแอนติบอดีในระยะต้นของโรค (early detection) สำหรับการใช้ผล microscopic agglutination test (MAT) ที่มีผลบวก titer > 1:400 เป็นวิธีมาตรฐาน พบว่าชุดทดสอบ LepProt_M/G มีความไว ค่าทำนายผลบวก และค่าทำนายผลลบ สูงกว่า SD_M/G ยกเว้น SD_M มีความ จำเพาะ (ร้อยละ 100) สูงกว่า LepProt_M (ร้อยละ 91.7) โดยสรุปโครงการนี้ได้ผลิตต้นแบบผลิตภัณฑ์สองชิ้น คือ ชุดทดสอบแบบรวดเร็วการตรวจวินิจฉัยโรคสครับไทฟัส ชนิด IgM/IgG และชุดทดสอบแบบรวดเร็วการตรวจวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรสิส ชนิด IgM/IgG ซึ่งมีความไว ความจำเพาะ ค่าทำนายผลบวก และค่าทำนายผลลบ ที่ดีมากสามารถวินิจฉัยโรคโรคสครับไทฟัสและโรคเลปโตสไปโรสิสได้รวดเร็วและถูกต้องแม่นยำth_TH
dc.description.sponsorshipสถาบันวิจัยระบบสาธารณสุขth_TH
dc.language.isothth_TH
dc.publisherสถาบันวิจัยระบบสาธารณสุขth_TH
dc.rightsสถาบันวิจัยระบบสาธารณสุขth_TH
dc.subjectระบาดวิทยาth_TH
dc.subjectไข้เฉียบพลันth_TH
dc.subjectเด็งกี่th_TH
dc.subjectDengueen_US
dc.subjectสครับไทฟัสth_TH
dc.subjectScrub typhusen_US
dc.subjectเลปโตสไปโรสิสth_TH
dc.subjectLeptospirosisen_US
dc.subjectผลิตภัณฑ์ วัคซีน และเทคโนโลยีทางการแพทย์ (Medical Products, Vaccines and Technologies)th_TH
dc.titleการพัฒนาและการประเมินชุดทดสอบสำหรับการตรวจหาแอนติบอดีต่อเด็งกี่/เลปโตสไปโรสิส/สครับไทฟัส ชนิด IgM/IgG ในชุดทดสอบเดียวกันth_TH
dc.title.alternativeDevelopment and Evaluation of Diagnostic Test for Dengue/Leptospirosis/Scrub typhus IgM/IgG Multiplex Antibody Detectionen_US
dc.typeTechnical Reportth_TH
dc.description.abstractalternativeAcute febrile illness (undiffenerentiated fever, AFI) is common disease and problem in worldwide including Thailand. Symptoms in early phase of AFI are non-specific resulting in mistakenly diagnosing it in acute febrile illness group. Laboratory diagnosis is important to confirm the definite clinical diagnosis. A rapid and accurate diagnostic test is essential tests for Point-of-care diagnosis. The objective was to generate the template products for diagnosis of scrub typhus and leptospirosis based on the principle of immunochromatrogaphy with gold nanoparticles (strip test). In preparation of recombinant proteins, the specific primers of entire genes were designed. PCR product from extracted DNA was cloned into plasmid and then selected positive clones were performed by PCR and restriction fragment analysis. Recombinant plasmids were transformed into expression cells. The characterized and purified recombinant proteins for scrub typhus and leptospirosis were 56 kDa proteins from Orientia tsutsugamushi prototype strains of Karp, Kato and Gilliam and 25 kDa protein of (Electron transfer flavoprotein subunit beta, ETF_beta), respectively. In the development of scrub typhus test kit, the nucleotide sequences of the recombinant proteins of all three strains showed the identity percentage of 97.8, 97.7 and 97.4 respectively. IgM/IgG immunoreactivity indicated that the recombinant proteins could be used as excellent antigens for antibody detection against all three strains and others two strains of TA716 and TA763. Evaluation of scrub typhus test kit IgM (Scrub_M) and IgG (Scrub_G) by using immunofluorescence assay (IFA) as a reference test. The titer >1:400 of IFA_M/G was considered to be positive. Scrub_M/G were tested in 318 sera from 100 scrub typhus patients and 218 non-scrub typhus patients (53 leptospirosis, 96 dengue, 30 murine typhus and 39 unknown). Scrub_M/G yielded the values of sensitivity, specificity; positive predictive value and negaitive predictive value were 97.0%, 100%, 100% and 98.6%, respectively. Scrub_M showed the values of sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV) and negaitive predictive value (PNV) were 81%, 100%, 100 and 92.0, respectively. Scrub_G showed the values of sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV) and negaitive predictive value (PNV) were 93.0%, 100%, 100 and 96.9, respectively. Evaluation of leptospirosis test kit IgM (LepProt_M) and IgG (LepProt_G) with recombinant ETF protein as antigen (version 1), was tested in 60 sera by using immunofluorescence assay (IFA) as a reference test. Correlation of (LepProt_M) and LepLPS_M with LPS as antigen was observed. The titer >1:400 of IFA_M/G was considered to be positive. LepProt_M and LepLPS_M gave the same negative results of 43.5 in sera with IFA_M (titer <1:50). In the group of positive results for IFA_M, LepProt_M gave the negative results of 44.4 (4/9 samples) while LepLPS_M yielded 100% of positive results. LepProt_M and LepProt_G which were further developed to be version 2 as compared with commercial kit SD BIOLINE Leptospira IgM/IgG (SD Lep_M/G) which demonstrating sensitivity of 96.2% and specificity of 95.7%, was evaluated The results showed that leptospiral isolation as reference standard test could not be used as a tool of evaluation. However, LepProt_M gave the higher rate than SD Lep_M in antibody detection of early phase of illness. Using microscopic agglutination test (MAT) as reference test, the sera in the positive group (titer > 1:400) showed that LepProt_M/G yieled the the values of sensitivity, PPV and PNV were higher than SD_M/G, except specificity of SD_M was higher than LepProt_M (100% vs 91.7%). In conclusion, two template products of rapid diagnostic tests were Scrub_M and Scrub_G (for Scrub typhus) and LepProt_M and IgG LepProt_G (for leptospirosis) with high sensitivity, specificity; positive predictive value and negaitive predictive value.en_US
dc.identifier.callnoWC630 อ858ก 2560
dc.identifier.contactno57-051
dc.subject.keywordโรคฉี่หนูth_TH
.custom.citationอุไรวรรณ โฆษิตานนท์, กัลลยานี ดวงฉวี, ธารารัชต์ ธารากุล, วุฒิกรณ์ รอดความทุกข์, นภัสวรรณ บุญสาธร and สุธี ยกส้าน. "การพัฒนาและการประเมินชุดทดสอบสำหรับการตรวจหาแอนติบอดีต่อเด็งกี่/เลปโตสไปโรสิส/สครับไทฟัส ชนิด IgM/IgG ในชุดทดสอบเดียวกัน." 2560. <a href="http://hdl.handle.net/11228/4764">http://hdl.handle.net/11228/4764</a>.
.custom.total_download59
.custom.downloaded_today0
.custom.downloaded_this_month0
.custom.downloaded_this_year3
.custom.downloaded_fiscal_year5

Fulltext
Icon
Name: hs2350.pdf
Size: 2.153Mb
Format: PDF
 

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record