บทคัดย่อ
คณะวิจัยได้ต่อยอดงานวิจัย จากสิทธิบัตรที่เกี่ยวกับแอปตาเมอร์ที่จับจำเพาะกับโปรตีนไกลเคทเตดอัลบูมิน และอัลบูมิน ศึกษาคุณสมบัติแอปตาเมอร์ดังกล่าวเพิ่มเติม เพื่อพัฒนาให้มีประสิทธิภาพมากขึ้น และนำแอปตาเมอร์ดังกล่าวไปพัฒนาต่อเป็นชุดตรวจ 3 รูปแบบ คือ (1) แบบการวัดสัญญาณฟลูออเรสเซนต์โดยใช้วัสดุนาโนร่วมด้วย (2) แบบเคมีไฟฟ้า และ (3) แบบวัดโมเลกุลเดี่ยวด้วยนาโนพอร์
ภาพรวมของผลงานดำเนินงานในปีที่ 1 เป็นไปตามแผนงานที่วางไว้ โดยคณะวิจัยสามารถพัฒนาเทคนิคการตรวจวัดไกลเคทเตดอัลบูมิน ในระดับห้องปฏิบัติการสำเร็จแล้ว 2 แบบ และดำเนินการยื่นขออนุสิทธิบัตรเรียบร้อยแล้วนั่นคือ
(1). กรรมวิธีการตรวจไกลเคทเตดอัลบูมินโดยการใช้แอปตาเมอร์ ร่วมกับสารละลายกราฟีนออกไซด์ (อนุสิทธิบัตรเลขที่ 1403001740 ยื่นเมื่อวันที่ 23 ธ.ค.2557) โดยวิธีการนี้อาศัยหลักการยับยั้งการส่งสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ของกราฟีนออกไซด์ เมื่อจับกับดีเอ็นเอแอปตาเมอร์ที่ติดสลากด้วยสารฟลูออเรสเซนต์ ในสภาวะที่มีโปรตีนไกลเคทเตดอัลบูมิน แอปตาเมอร์จะถูกปล่อยออกมาจากกราฟีนออกไซด์ แล้วมาจับกับโปรตีนไกลเคทเตดอัลบูมิน และส่งสัญญาณฟลูออเรสเซนต์อีกครั้ง วิธีการที่พัฒนาขึ้นนี้สามารถนำไปวิเคราะห์โปรตีนไกลเคทเตดอัลบูมินจากซีรัมของคนได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยมีค่าความเข้มข้นต่ำสุดที่วัดได้อยู่ที่ 50 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ซึ่งมีความไวกว่าชุดตรวจทางการค้าที่ใช้หลักการจับกันของแอนติบอดีกับโปรตีนถึง 2 เท่า นอกจากนี้วิธีการที่พัฒนาขึ้นในโครงการนี้ยังมีขั้นตอน และวิธีการที่ไม่ยุ่งยาก สามารถอ่านผลได้ภายใน 30 นาที จึงสามารถที่จะนำไปพัฒนาต่อเพื่อใช้สำหรับติดตามภาวะแทรกซ้อน และวิวัฒนาการของโรคเบาหวานในผู้ป่วยจริงตามโรงพยาบาลทั่วไปได้ โดยได้มีการทดสอบกับตัวอย่างชีรัมจริง ในกลุ่มที่เป็นเบาหวาน และกลุ่มคนปกติจำนวน 20 ตัวอย่าง พบว่าวิธีการที่คณะวิจัยพัฒนาขึ้นนี้สามารถแยกกลุ่มผู้ป่วยเบาหวาน ออกจากกลุ่มคนปกติได้อย่างชัดเจน
(2). กรรมวิธีการตรวจวัดไกลเคทเตดอัลบูมินโดยการใช้แอปตาเมอร์ ร่วมกับวิธีทางเคมีไฟฟ้า (อนุสิทธิบัตรเลขที่ 1503000656 ยื่นเมื่อวันที่ 1 พ.ค 2558) ซึ่งเกี่ยวข้องกับการพัฒนาชุดตรวจหาโปรตีนไกลเคทเตดอัลบูมิน โดยใช้เทคนิคทางเคมีไฟฟ้า ร่วมกับแอปตาเมอร์ ซึ่งมีขั้นตอนในการวัดปริมาณโปรตีนไกลเคทเตดอัลบูมิน ที่ง่าย สะดวก รวดเร็ว ต้นทุนต่ำ ใช้ปริมาณสารที่ใช้วัดน้อย และยังสามารถตรวจวัดได้ที่ความเข้มข้นของโปรตีนเป้าหมายต่ำถึงระดับไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร โดยการยึดติดดีเอ็นเอแอปตาเมอร์ที่จำเพาะต่อโปรตีนไกลเคทเตดอัลบูมิน ลงบนพื้นผิวขั้วไฟฟ้าพิมพ์สกรีนคาร์บอนด้วยแรงดึงดูดจำเพาะของสเตรปตาวิดิน – ไบโอติน โดยกรรมวิธีนี้ สามารถตรวจวัดความเข้มข้นของโปรตีนไกลเคทเตด อัลบูมิน ที่ถูกจับโดยแอปตาเมอร์ ผ่านการวัดสัญญาณเคมีไฟฟ้าที่เกิดจากการเคลื่อนที่ของอิเล็กตรอนผ่านขั้วไฟฟ้า โดยกรรมวิธีนี้สามารใช้ในการตรวจความเข้มข้นของไกลเคทเตดอัลบูมินได้ในซีรัมจริงในห้องปฏิบัติการ โดยในการดำเนินงานในปีที่ 2 นี้จะทำการพัฒนาให้วิธีดังกล่าวสามารถตรวจวัดเปอร์เซ็นต์ของไกลเคทเตดอัลบูมินในซีรัม และจะทำการทดสอบกับตัวอย่างซีรัมของผู้ป่วยเบาหวานในระดับห้องปฏิบัติการด้วย
เทคนิคที่พัฒนาขึ้นนี้ใช้ได้ผลดีในระดับห้องปฏิบัติการ และกำลังถูกพัฒนาต่อไปเพื่อให้สามารถใช้ได้ผลดีในระดับภาคสนามที่เป็นกลุ่มตัวอย่างผู้ป่วยเบาหวาน และพร้อมกันนั้นทางกลุ่มนักวิจัยจะทำการเผยแพร่ข้อมูลข่าวสารต่างๆของผลงานวิจัยเหล่านี้สู่สาธารณชน โดยเน้นกลุ่มเป้าหมายหลักในเบื้องต้น ได้แก่ โรงพยาบาล, องค์การเภสัชกรรม เพื่อให้หน่วยงานเหล่านี้รับทราบ และทดลองนำผลผลิตวิจัยไปใช้ โดยจะมีการสาธิตการใช้ และการติดตามประเมินผลและปรับปรุง ลำดับต่อไปจะทำการสื่อสารให้ประชาชนทั่วไปเข้าใจรับทราบโดยทาง Website เป็นต้น
บทคัดย่อ
Measuring combination of blood sugar and glycated hemoglobin (HbA1c) is a way to monitor the diabetes progression. However, HbA1c level in the red blood cell keeps constant during its life cycle (120 days), which is somehow too long to be monitored in severe cases. In addition, in condition effecting red blood cell structure or hemoglobin production (hemolytic anemia, thalassemia, and etc.), HbA1c level can be unreliable. Therefore, monitoring the intermediate indicator outside the red blood cell could improve the way to control diabetes progression and treatment.
The percentage of GHSA in normal serum is 0.6-3.0% whereas in diabetic patient serum has been found to be 2-5 folds higher than normal level. It has become clear that GHSA can be a marker of intermediate glycation and also a causative agent of the damage of diabetes complications, such as atherosclerosis, coronary artery disease and kidney failure. GHSA testing has been strongly recommended for monitor glycemic control for diabetes mellitus in hemodialysis patient and a test for complications associated with diabetes, which can also serve as a monthly report card for type 1 diabetes in the USA. Several GHSA detection platforms have been developed, which include enzymatic assay, colorimetric assay, high performance liquid chromatography, affinity chromatography and immunoassay. Enzymatic and chromatography based assay have demonstrated higher %GHSA due to nonspecific enzymes and imprecise of the binding site on the resin bead. The lower %GHSA has been observed in the immunoassay using antibody that specifically bind GHSA however using antibody are high cost and easily to be denatured
This research program are focusing on development of aptasensor platform for detection of glycated albumin for diabetes mellitus detection and monitoring. Three platforms, which are graphene oxide-aptamer, electrochemical and nanopore sensors, have been developed.
Considering the graphene oxide-aptamer approach, the fluorescence aptamer was fluorescence labeled and incubated with the graphene oxide (GO) and fluorescence signal was quenched. The fluorescence signal was recovered in the presence of GHSA protein. We tested the approach with three known proteins, which were GHSA, HSA, and streptavidin. HSA structure is similar as GHSA structure but streptavidin structure is totally different from the GHSA structure. These results indicated that GO-aptamer approach is specific method for in vitro GHSA detection. After optimization of the serum dilution, we investigated LOD of the GO-aptamer approach at serum dilution 1:5000. We found the LOD of 50 µg/ml at serum dilution 1:5000 with the linear correlation between 0.05 µg/ml and 3 µg/ml
For the electrochemical sensor development, the aptamer was coated on carbon electrodes and electrochemical signal was detected when the aptamer bind glycated albumin. By using this approach, we could detect glycated albumin in PBS buffer and also in serum with the LOD of 30 µg/ml
For the nanopore analysis, we have set nanopore measurement and prepared all components for the analysis. Next study, all components will be assembled and the sensitivity and specificity of the system will be tested.
These results demonstrated that our GO-aptamer and electrochemical approach could potentially be used for simple and sensitive detection and monitoring of GHSA in human, which is an intermediate protein marker for diabetes mellitus. Next study, we will do field test for both GO-aptamer and electrochemical approach.
