บทคัดย่อ
การกลายพันธุ์ (mutation) ของยีนนิวคลีโอฟอสมิน (nucleophosmin; NPM1) เป็นการเปลี่ยนแปลงในระดับโมเลกุลที่พบมากที่สุดในโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวเฉียบพลันชนิดมัยอีลอยด์ (acute myelogenous leukemia; AML) โดยเฉพาะในผู้ป่วยที่มีจำนวนและลักษณะโครโมโซมปกติ (normal karyotype) นอกจากนี้การกลายพันธุ์ของยีน NPM1 ยังเป็นตัวบ่งชี้ที่ดีสำหรับการพยากรณ์โรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวเฉียบพลันชนิดมัยอีลอยด์ ดังนั้นการตรวจพบการกลายพันธุ์ของยีนจึงมีความสำคัญในการพยากรณ์ความเสี่ยงและการตัดสินใจของแพทย์ใช้ในการวางแผนการรักษาผู้ป่วย การศึกษาในครั้งนี้ได้ทำการพัฒนาชุดน้ำยาที่สามารถตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน NPM1 และสามารถตรวจการกลายพันธุ์ได้พร้อมกัน ภายในปฏิกิริยาเดียวถึง 4 ชนิด (mutation type A, B, D และ J) ด้วยเทคนิค Enhanced-improved and complete enrichment-co amplification at lower denaturation temperature-polymerase chain reaction (E-ice-COLD-PCR) ร่วมกับเทคนิค High-resolution melting (HRM) analysis วิธีการทดลอง: เทคนิค E-ice-COLD-PCR จะอาศัย blocker probe ที่จับได้จำเพาะกับ wild-type แต่จับกับ mutant แบบไม่จำเพาะ เมื่อเพิ่มอุณหภูมิไปที่ critical temperature (Tc) เฉพาะ blocker probe-mutant เท่านั้นที่จะถูกแยก ทำให้สามารถเพิ่มจำนวนได้เฉพาะ mutant โดยใช้ DNA template ที่ความเข้มข้น 5 นาโนกรัม ในน้ำยาที่มีส่วนผสมดังนี้ 2x NPM1 HRM master mix ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 1x, NPM-LNA Probe ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 400 นาโนโมลาร์ และปรับปริมาตรสุดท้ายให้ครบ 25 ไมโครลิตรด้วยน้ำกลั่น จากนั้นทำปฏิกิริยา ดังนี้ initial denaturation ที่ 95°C เวลา 3 นาที หลังจากนั้นตามด้วย denaturation ที่ 95°C 5 วินาที probe hybridization step ที่ 70°C เป็นเวลา 30 วินาที ตามด้วย critical temperature ที่อุณหภูมิ 88°C เป็นเวลา 40 วินาที primer annealing ที่ 60°C เป็นเวลา 10 วินาที และ extension ที่ 72°C 30 วินาที ทำซ้ำ 40 รอบ สุดท้ายตามด้วย final extension ที่ 72°C เป็นเวลา 3 นาที หลังจากนั้นทำ melting curve analysis โดยค่อยๆ เพิ่มอุณหภูมิทีละ 2°C จากอุณหภูมิ 65°C จนถึง 85°C ด้วยเครื่อง Realtime-PCR หรือ conventional PCR machine ซึ่งตัวอย่างของการศึกษานี้ใช้ตัวอย่างเลือดจากผู้ป่วยโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาว จำนวน 83 ตัวอย่าง จากโรงพยาบาลมหาราชนครเชียงใหม่ ทำการเปรียบเทียบผลการตรวจด้วยชุดน้ำยา NPM1 HRM master mix ด้วยเทคนิค E-ice-COLD-PCR กับวิธี standard PCR และวิธี direct sequencing ผลการทดลอง: จากผลการศึกษาพบว่าชุดน้ำยา 2x NPM1 HRM master mix ให้ผลความไวและความจำเพาะเทียบเท่ากับวิธี direct sequencing โดยพบการกลายพันธุ์ของยีน NPM1 ในผู้ป่วย 9 ราย จากทั้งหมด 83 ราย นอกจากนั้นเมื่อทำการยืนยันการกลายพันธุ์ของยีน ด้วยวิธี direct sequencing โดยใช้ PCR product จากวิธี E-ice-COLD-PCR พบว่าผล sequencing ในตัวอย่างทั้ง 9 ราย มีความสอดคล้องกับวิธี E-ice-COLD-PCR รวมทั้งสามารถแปลผลได้ง่าย โดยให้ผลเป็น type A mutation แต่เมื่อใช้ PCR product จากวิธี standard PCR พบว่าให้ผลบวกในผู้ป่วย เพียง 8 ราย เนื่องจากในตัวอย่างมีสัดส่วนของการกลายพันธุ์ของยีนต่ำ ทำให้ PCR product ของยีนที่มีการกลายพันธุ์ถูกบดบังด้วย PCR product ของ wild-type และรบกวนการอ่านผลของวิธี direct sequencing ดังนั้นการทำ E-ice-COLD-PCR ก่อนยืนยันผลด้วยวิธี direct sequencing จึงสามารถเพิ่มความไวของวิธี direct sequencing ได้ สรุปผลการทดลอง: จากการเปรียบเทียบระหว่างวิธี standard PCR และวิธี direct sequencing กับชุดน้ำยา 2x NPM1 HRM master mix สามารถสรุปได้ว่าเทคนิคการตรวจและชุดน้ำยา 2x NPM1 HRM master mix ที่พัฒนาขึ้นตรวจหาการกลายพันธุ์ได้ครอบคลุมทั้ง 4 ชนิด ภายในปฏิกิริยาเดียว รวมทั้งสามารถใช้กับทั้งเครื่อง real-time PCR และ conventional PCR ได้ และยิ่งไปกว่านั้นสามารถตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน NPM1 ปริมาณต่ำได้ ในกรณีที่มี background ของ wild-type สูงและให้ผลที่น่าเชื่อถือ สามารถนำไปใช้ตรวจหาการกลายพันธุ์ NPM1 ได้ในโรงพยาบาลที่มีการวินิจฉัยและรักษาผู้ป่วย AML ซึ่งไม่ต้องอาศัยเครื่องมือที่มีราคาแพง และผู้ชำนาญการในการทำหรือแปลผล
บทคัดย่อ
Mutations of nucleophosmin (NPM1) gene represent the most frequent molecular alteration in acute myelogenous leukemia (AML), especially in the AML patients with normal karyotype. Moreover, NPM1 gene mutations have been shown to carry favorable prognostic significance in AML. Therefore, Screening of NPM1 mutations show valuable clinical importance in terms of risk assessment and treatment decisions of physician in AML patients. In this study, we developed a in house test kit for detection of NPM1 gene mutation cover 4 types (type A, B, D and type J) in 1 reaction based on Enhanced-improved and complete enrichment-co amplification at lower denaturation temperature-polymerase chain reaction (E-ice-COLD-PCR) combined with High-resolution melting (HRM) analysis. Method: For E-ice-COLD-PCR, blocker probe is very importance to block wild-type amplification. Blocker probe hybridized complete match with wild-type sequence while incomplete match with mutant sequence. After critical temperature step in each cycle, blocker probe allows completely denature mutant-blocker probe heteroduplex while wild-type-blocker probe heteroduplex remain strongly hybridized, which only allow the amplification of mutant. The PCR reaction was performed using 1x NPM1 HRM master mix, 400 nM of NPM-LNA probe, 5 ng of genomic DNA and sterile water with a total reaction volume of 25 μL. The thermocycling program consisted of an initial denaturation at 95°C for 3 min followed by 40 cycles of denaturation at 95°C for 5 s, probe hybridization at 70°C for 30 s, critical denaturation at 88°C for 40 s, primer annealing at 60°C for 10 s and extension at 72°C for 30 s, with a final extension at 72°C for 3 min. The final step was melting curve with continuous increase in temperature from 65°C to 85°C (0.2°C per acquisition, 5 s hold before each acquisition) by using CFX96 Touch Real-Time PCR or Mini MJ Thermal Cycler (conventional PCR machine) A total of 83 AML blood samples from Maharaj Nakorn Chiang Mai Hospital were evaluated by NPM1 HRM master mix, standard PCR and direct sequencing. Results: we show herein 2x NPM1 HRM master mix exhibited similar sensitivity and specificity with direct sequencing. NPM1 mutations were detected in 9 of 83 AML patients with 2x NPM1 HRM master mix. Moreover, The PCR products from E-ice-COLD PCR were confirmed by direct sequencing. The result show that 100% concordance with E-ice-COLD-PCR assay and direct sequencing with type A mutation and easily to interpretation. Interestingly, The PCR products from standard PCR show that 8 of 83 patients were positive. One sample showed inconsistent result between standard PCR assay and direct sequencing. Perhaps, the low level of mutations in wild-type background interferes the direct sequencing led to verification of the mutation sample as wild-type. Therefore, performing E-ice-COLD-PCR prior to direct sequencing allow substantial increasing the limit of detection of direct sequencing. Conclusions: Compared to standard PCR and direct sequencing, a new test kit, 2x NPM1 HRM master mix was shown to detect mutations in the NPM1 gene cover 4 types in 1 reaction. Moreover, E-ice-COLD- PCR is a PCR-based method that can be use for enrichment low level of mutated in mixtures of wild-type and mutant allele. E-ice-COLD PCR protocol can easily be integrated in the routine molecular diagnosis of AML using Real-time PCR or conventional PCR machine.
