การประเมินเทคนิคทางอณูวิทยาเพื่อวินิจฉัยวัณโรค และวัณโรคดื้อยาหลายขนาน ปีที่ 2

Abstract

วัณโรค (tuberculosis: TB) และวัณโรคดื้อยาหลายขนาน (multidrug-resistant TB: MDR-TB) เป็นหนึ่งในปัญหาสาธารณสุขสำคัญของประเทศไทย ที่ผ่านมาพบว่าความครอบคลุมในการรักษา TB และ MDR-TB อยู่ในอัตราที่ต่ำโดยหนึ่งในสาเหตุสำคัญมาจากการที่ผู้ติดเชื้อจำนวนมาก (มากกว่าร้อยละ 40) ไม่ได้รับการตรวจวินิจฉัยหรือไม่ได้ลงทะเบียนเพื่อรับการรักษา เพื่อตอบสนองต่อแผนยุทธศาสตร์วัณโรคระดับชาติ พ.ศ. 2560-2564 เพื่อการยุติวัณโรคในประเทศไทยภายในปี พ.ศ. 2578 โดยเฉพาะยุทธศาสตร์ ที่ 5 การวิจัยและพัฒนานวัตกรรมการตรวจวินิจฉัยแบบใหม่ การศึกษาครั้งนี้จึงมีเป้าหมายเพื่อประเมินประสิทธิภาพการนำวิธีการทางอณูวิทยาที่ได้พัฒนาต่อยอดจากงานวิจัยก่อนหน้านี้มาใช้ในการวินิจฉัย TB และ MDR-TB อันจะนำไปสู่แนวทางการประยุกต์ใช้ที่ช่วยลดระยะเวลาการตรวจวินิจฉัยและเพิ่มประสิทธิภาพการรักษาและการควบคุมการแพร่ระบาดของ TB และ MDT-TB ในประเทศไทย การวิจัยของโครงการแบ่งออกเป็นสองระยะ ระยะที่ 1 ทำการประเมินประสิทธิภาพการนำวิธีการทางอณูวิทยา ได้แก่ MDR-TBD-II และ INH-RD ที่อาศัยหลักการ multiplex real time PCR และ high-resolution melting curve (HRM) มาใช้ในการวินิจฉัย TB และ MDR-TB โดยทดสอบกับตัวอย่าง DNA ของเชื้อ M. tuberculosis (Mtb) isolates และระยะที่ 2 ทำการประเมินประสิทธิภาพการนำเทคนิค Immunomagnetic separation (IMS) ซึ่งใช้ magnetic bead particles ที่เคลือบด้วยโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อ Ag85 ของเชื้อ Mycobacterium spp. ร่วมกับวิธี confrontingtwo pair primers PCR (PCR-CTPP), MDR-TBD-II และ INH-RD มาใช้ในการวินิจฉัย TB และ MDR-TB โดยตรงจากสิ่งส่งตรวจเสมหะแล้วทำการเปรียบเทียบผลที่ได้กับการตรวจด้วยวิธี Xpert MTB/RIF การเพาะเลี้ยงเชื้อ การตรวจพิสูจน์ด้วยวิธีมาตรฐานทางห้องปฏิบัติการและเทคนิค DNA sequencing ในการทดสอบชุดตรวจ MDR-TBD-II กับตัวอย่าง DNA ของเชื้อ M. tuberculosis (n=130) แสดงให้เห็นว่าชุดตรวจทั้งสองมีประสิทธิภาพสูงในการตรวจวินิจฉัยวัณโรค มีความสอดคล้องกับวิธีเพาะเลี้ยงเชื้อมาตรฐาน 100% และมีความจำเพาะสูงในการระบุเชื้อวัณโรคที่ไวต่อยา RIF และการกลายพันธุ์ของยีน rpoB สอดคล้องกับวิธีการทดสอบความไวมาตรฐานด้วย agar proportional method (phenotypic DST) และวิธี DNA sequencing สูงถึงร้อยละ 96.7 (58/60) และ 98.3 (58/59) นอกจากนี้ ยังสามารถวินิจฉัยการดื้อต่อยา RIF ของเชื้อวัณโรคที่มีการกลายพันธุ์ของยีน rpoB ที่ codons 531 และ 526 ซึ่งเป็นตำแหน่งที่พบบ่อยที่สุดได้ที่อัตราร้อยละ 93.3 (28/30) และ 83.3 (10/12) อย่างไรก็ตามชุดตรวจนี้ยังมีข้อจำกัดในการตรวจวินิจฉัยการดื้อต่อยา RIF ในเชื้อวัณโรคที่มีการแสดงออกของการดื้อต่อยา RIF ที่มีลักษณะทางพันธุกรรมดังต่อไปนี้ (1) ไม่มีการกลายพันธุ์ของยีน rpoB (2) มีกลายพันธุ์ของยีน rpoB ที่จัดเป็นชนิด class-3 SNP และ class-4 SNP หรือ (3) มีการกลายพันธุ์ของยีน rpoB ที่ codons 516 และ 522 ซึ่งพบได้ค่อนข้างน้อย ส่วนการตรวจวินิจฉัยเชื้อวัณโรคที่ดื้อต่อยา INH และไวต่อยา INH ด้วยชุดตรวจ INH-RD (n=166) ให้ผลสอดคล้องกับวิธี phenotypic DST ในอัตราที่สูงเท่ากับร้อยละ 98.1 (105/107) และ 94.9 (56/59) ชุดตรวจนี้สามารถตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน katG ที่ codon 315 ซึ่งเป็นตำแหน่งที่พบบ่อยที่สุดได้สูงถึงร้อยละ 97.9 (95/97) สามารถตรวจพบการกลายพันธุ์ของ inhA promoter ได้ในอัตราร้อยละ 92.3 (12/13) และให้ผลสอดคล้องกับวิธี DNA sequencing สูงถึงร้อยละ 94.9 (56/58) ในการตรวจเชื้อ Mtb isolates ที่ไม่มีการกลายพันธุ์ในยีน katG และ inhA promoter (wild type) การประเมินประสิทธิภาพของวิธี PCR-CTPP และ MDR-TBD-II ร่วมกับวิธี IMS ในการวินิจฉัยวัณโรคโดยตรงจากสิ่งส่งตรวจเสมหะจำนวน 259 ตัวอย่าง เมื่อเทียบกับวิธี culture พบว่า sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV) และ negative predictive value (NPV) ของวิธี PCR-CTPP และ MDR-TBD-II เท่ากับ 80.0, 82.4, 84.2 และ 77.8% ตามลำดับ และ 70.7, 91.6, 90.8 และ 72.7% ตามลำดับ ถึงแม้ว่า Xpert MTB/RIF และ AFB smear มีค่า sensitivity (97.9% and 93.6%) ที่สูงกว่า แต่วิธี Xpert MTB/RIF ให้ค่า specificity (81.5%) ต่ำกว่าวิธี PCR-CTPP และ MDR-TBD-II อย่างไรก็ตามผลการทดสอบทางสถิติด้วย Chi-square test พบว่า PCR-CTPP, MDR-TBD-II, Xpert MTB/RIF และ AFB smear ให้ผลการตรวจหาวัณโรคแตกต่างกับวิธี culture อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (x2=100.11, p-value=0.0064; x2=102.47, p-value=0.0062; x2 = 170.96, p-value=0.0037; x2=155.92, p-value=0.0041 ตามลำดับ) นอกจากนี้การใช้สถิติ Cochran’s Q tests พบว่าในบรรดาวิธีต่างๆ ได้แก่ IMS-CTPP, MDR-TBD-II, Xpert MTB/RIF และ AFB Smear มีอย่างน้อยหนึ่งวิธีที่ให้ผลการตรวจวินิจฉัยวัณโรคแตกต่างจากผลการตรวจที่ได้จากวิธีอื่นอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (Cochran’s Q=24.32, p-value=0.0000) การตรวจหาการดื้อต่อยา RIF ด้วย MDR-TBD-II ให้ค่า sensitivity และ specificity เทียบกับ phenotypic DST ที่ 70.0% และ 69.8% ซึ่งต่ำกว่าวิธี Xpert MTB/RIF (84.85% และ 98.57%) อย่างไรก็ตามผลการทดสอบทางสถิติพบว่าชุดตรวจ MDR-TBD-II ให้ผลการตรวจหาการดื้อต่อยา RIF ไม่แตกต่างกับวิธี phenotypic DST (x2=5.75, p-value=0.11) ในขณะที่ Xpert MTB/RIF ให้ผลการตรวจหาการดื้อต่อยา RIF แตกต่างกับวิธี phenotypic DST (x2=67.97, p-value=0.0094) อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ส่วนการตรวจหาการดื้อต่อยา INH ด้วย INH-RD มี sensitivity และ specificity เทียบกับ phenotypic DST เท่ากับ 83.3% และ 74.2% ผลการทดสอบทางสถิติพบว่าชุดตรวจ INH-RD ให้ผลการตรวจหาการดื้อต่อยา INH ไม่แตกต่างกับวิธี phenotypic DST (x2=8.94, p-value=0.0709) ผลการศึกษาที่ได้แสดงถึงศักยภาพในการนำชุดตรวจ MDR-TBD-II และ INH-RD ไปใช้ในการตรวจพิสูจน์และทดสอบความไวของเชื้อวัณโรคและวัณโรคดื้อยาหลายขนานจากเชื้อวัณโรค อย่างไรก็ตาม การนำวิธี PCR-CTPP, MDR-TBD-II และ INH-RD ที่ใช้ร่วมกับ IMS ยังมีข้อจำกัดในการวินิจฉัยวัณโรคและวัณโรคที่ดื้อยาโดยตรงจากตัวอย่างทางคลินิก ความไวและความจำเพาะที่พบว่าลดลงในทุกการทดสอบบ่งชี้ถึงปริมาณและคุณภาพของ DNA ที่สกัดได้อาจไม่เพียงพอ การพัฒนาวิธีการสกัด DNA จากสิ่งส่งตรวจโดยตรงจึงยังมีความจำเป็นเพื่อให้สามารถลดเวลาครบวงงาน (turnaround time) ในการตรวจทั้งหมดให้เหลือเพียง 1-2 วัน ซึ่งจะใกล้เคียงกับการตรวจด้วย Xpert MTB/RIF และ TB-LAMP และรวดเร็วกว่าวิธี Line probe assay ชุดตรวจ MDR-TBD-II และ INH-RD มีราคาต้นทุนที่คำนวณต่อปฏิกิริยาไม่แพงประมาณ 250 บาท ต่อ 20-μl reaction (รวมค่าน้ำยาสกัด DNA, น้ำยา real time PCR และวัสดุสิ้นเปลือง) และยังสามารถทำการทดสอบโดยใช้ 96-well PCR plate ได้สูงที่สุดถึง 96 ตัวอย่างพร้อมกัน แต่วิธีทั้งสองต้องการเครื่อง real time PCR ที่มีราคาค่อนข้างสูงและผู้ปฏิบัติงานที่มีความชำนาญ การใช้ PCR-CTPP ทำได้ง่าย สามารถใช้ยืนยันวัณโรคได้รวดเร็วขึ้นและราคาประหยัด (150 บาท ต่อ 25-μl reaction) แต่ยังต้องอาศัยการตรวจผลด้วย Gel electrophoresis ดังนั้นการวิจัยและพัฒนาต่อยอดจากผลงานวิจัยครั้งนี้จึงมีความจำเป็นอย่างยิ่งเพื่อช่วยให้เกิดการสร้างเทคโนโลยีต้นแบบสำหรับการตรวจวินิจฉัยวัณโรคและวัณโรคดื้อยา ณ จุดบริการผู้ป่วยและนำไปสู่การยุติปัญหาวัณโรคของประเทศที่ยั่งยืนต่อไปในอนาคต