การพัฒนาชุดตรวจวินิจฉัยหาแอนติเจนของเลปโตสไปโรซีส และไข้เด็งกี่ แบบอิมมูโครมาโทกราฟีที่ตรวจได้ทั้งสองโรคในชุดตรวจชุดเดียว

Abstract

จุดประสงค์หลักของการศึกษาโครงการวิจัยนี้คือการพัฒนาชุดตรวจสำเร็จรูปในรูปแบบอิมมิวโนโครมาโทกราฟี (ICT) เพื่อใช้ในการตรวจวินิจฉัยโรคฉี่หนู (leptospirosis) และโรคไข้เลือดออก (Dengue fever) ในลักษณะการตรวจหาแอนติเจนของเชื้อ โดยได้ดำเนินการพัฒนาชุดตรวจสำเร็จรูปในรูปแบบอิมมิวโนโครมาโทกราฟี เพื่อใช้ในการตรวจวินิจฉัยโรคฉี่หนู ดังนี้ 1. การคัดเลือกคู่ของแอนติบอดีที่เหมาะสมในการตรวจแอนติเจนของเชื้อเลบโตสไปรา (โมโนโคลนาล แอนติบอดี โคลน LD5, LE1 และ LF9 จากคณะแพทยศาสตร์ศิริราชพยาบาล มหาวิทยาลัยมหิดล และโคลน 3, 81 และ 82 จากคณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย) 2. การพัฒนารูปแบบที่เหมาะสมของชุดตรวจแบบ ICT แบบ MAb1-MAb2 หรือ MAb-PAb หรือ PAb-MAb 3. ดำเนินการเก็บตัวอย่างซีรัมจากผู้ป่วยที่มีไข้ซึ่งได้รับความอนุเคราะห์จากศาสตราจารย์แพทย์หญิง ยุพิน ศุพุทธมงคล โรงพยาบาลศิริราช และ 4. ดำเนินการประเมินประสิทธิภาพของชุดตรวจที่ผลิตขึ้นโดยทำการตรวจสอบกับซีรัมที่เตรียมไว้เปรียบเทียบกับผลการวินิจฉัยที่ทราบแล้ว สำหรับกิจกรรมข้อที่ 1 ดำเนินการประเมินโดย รองศาสตราจารย์ ดร. สุรศักดิ์ วงศ์รัตนชีวิน ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น (คนกลาง) จากผลการประเมินพบว่า โมโนโคลนาล แอนติบอดีโคลน LD5 และ LE1 จากคณะแพทยศาสตร์ศิริราชพยาบาล เหมาะสมในการนำไปพัฒนาชุดตรวจเชื้อเลปโตสไปรา ดังนั้น ในการพัฒนาชุดตรวจแบบ ICT คณะผู้วิจัยใช้ MAbLE1 ติดฉลากอนุภาคทองคำ และ สเปรย์ลงบน conjugate pad และ MAbLD5 สเปรย์ลงบนแผ่นเมมเบรนที่ตำแหน่ง Test line สำหรับ Control line คณะผู้วิจัยใช้ Goat anti-mouse immunoglobulin ในอีกรูปแบบหนึ่ง คณะผู้วิจัยใช้ โพลีโคลนาล แอนติบอดี จากกระต่ายที่จำเพาะกับ pathogenic Leptospira ติดฉลากกับอนุภาคทองคำ และใช้ MAbLD5 เป็น Test line และ Goat anti-mouse immunoglobulin เป็น Control line ชุดตรวจที่พัฒนาขึ้นทั้งสองรูปแบบสามารถตรวจโปรตีนของเชื้อได้ต่ำที่สุดที่ 0.375 ไมโครกรัม และจำเพาะต่อเชื้อเลปโตสไปราโดยไม่ทำปฏิกิริยากับแบคทีเรียอื่น (นามาทดสอบ 27 สายพันธุ์) คณะผู้วิจัยได้ดำเนินการประเมินประสิทธิภาพของชุดตรวจที่ผลิตขึ้นโดยทำการตรวจสอบกับซีรัมที่เตรียมไว้จำนวน 60 ตัวอย่าง โดยทราบในภายหลังว่าเป็นซีรีมจากผู้ป่วยที่ได้รับการวินิจฉัยว่าติดเชื้อเลปโตสไปรา จำนวน 14 ตัวอย่าง ซีรัมจากผู้ป่วยที่ติดเชื้อสครัปไทฟัส 16 ตัวอย่าง และซีรัมจากผู้ป่วยที่ติดเชื้อไข้เลือดออกจานวน 30 ตัวอย่าง ผลการทดสอบด้วยชุดตรวจแบบ ICT พบว่าให้ผลบวกกับซีรัมจากผู้ป่วยที่เคยได้รับการวินิจฉัยว่าติดเชื้อเลปโตสไปราทุกตัวอย่างการทดสอบ อย่างไรก็ดี ชุดตรวจที่ผลิตขึ้นให้ผลบวกกับซีรัมผู้ป่วยที่เคยได้รับการวินิจฉัยว่าติดเชื้อสครัปไทฟัส 11 จาก 16 ราย และซีรัมจากผู้ป่วยที่เคยได้รับการวินิจฉัยว่าติดเชื้อไข้เลือดออก 3 ใน 30 ราย จากผลดังกล่าวจะพบว่าชุดตรวจแบบ ICT ที่พัฒนามี sensitivity 100%, specificity 70%, accuracy 77% ผลลบปลอม 0% และผลบวกปลอม 30% ดังนั้น เพื่อเป็นการยืนยันผลบวกปลอมที่เกิดขึ้น คณะผู้วิจัยจึงได้นำโปรตีนที่ Test line ของ strip ที่ให้ผลบวกด้วย Leptospira ICT test kit แต่เคยได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นซีรัมของผู้ป่วยสครัปไทฟัส ไปวิเคราะห์หาโปรตีนด้วย mass spectrometry ปรากฏว่าไม่พบแอนติเจนของเชื้อสครัปไทฟัส แต่พบโปรตีนของเชื้อเลปโตสไปรา จึงทำให้เชื่อว่าผลการวินิจฉัยที่ทราบมาก่อนน่าจะไม่ถูกต้อง สำหรับการประเมินประสิทธิภาพของชุดตรวจครั้งที่ 2 คณะผู้วิจัยได้รับตัวอย่างซีรัมจำนวน 248 ตัวอย่างจากศาสตราจารย์แพทย์หญิง ยุพิน ศุพุทธมงคล ผลการทดสอบพบว่า ได้ผลบวกกับเชื้อเลปโตสไปรา 201 ตัวอย่าง อย่างไรก็ตามคณะผู้วิจัยยังไม่ได้รับผลการเปรียบเทียบจากห้องปฏิบัติการของศาสตราจารย์แพทย์หญิง ยุพิน ศุพุทธมงคล คณะวิจัยได้ดำเนินการพัฒนาชุดตรวจแบบ ICT สำหรับตรวจหาเชื้อไข้เลือดออกโดยได้รับโมโนโคลนาลแอนติบอดีที่จำเพาะต่อไวรัสไข้เลือดออกจาก ดร. ชัญญา พุทธิขันธ์ จากหน่วยปฏิบัติการเทคโนโลยีชีวภาพทางการแพทย์ และหน่วยวิจัยไข้เลือดออก คณะแพทยศาสตร์ศิริราชพยาบาล โดยโมโนโคลนาลแอนติบอดี (SI4) ประกอบด้วยโมโนโคลนาลแอนติบอดี 4 ชนิด (เป็น IgG1 2 ชนิด และ IgG2b 2ชนิด) ถูกนำไปติดฉลากด้วยอนุภาคทองคำ สำหรับโมโนโคลนาลแอนติบอดี (SI1) ซึ่งเป็นชนิด IgM จะใช้เป็น Test line ส่วน Goat anti-mouse immunoglobulin จะใช้เป็น Control line เนื่องจากปริมาณของแอนติเจนและแอนติบอดีที่ใช้ในการพัฒนาชุดตรวจแบบ ICT นี้ยังไม่เพียงพอ ทำให้ชุดตรวจดังกล่าวยังไม่แล้วเสร็จ ขณะนี้ ดร. ชัญญา พุทธิขันธ์ และทีมวิจัยกำลังเตรียมแอนติเจนและแอนติบอดีให้เพียงพอต่อการนำไปพัฒนาชุดตรวจ ซึ่งจะทำให้แล้วเสร็จต่อไป