การพัฒนาและการประเมินชุดทดสอบสำหรับการตรวจหาแอนติบอดีต่อเด็งกี่/เลปโตสไปโรสิส/สครับไทฟัส ชนิด IgM/IgG ในชุดทดสอบเดียวกัน

Abstract

ไข้เฉียบพลัน (acute febrile illness หรือ undiffenerentiated fever) เป็นโรคที่พบบ่อยและเป็นปัญหาในประเทศต่างๆ ทั่วโลกรวมทั้งประเทศไทย อาการสำคัญ คือ ไข้และปวดศีรษะ ซึ่งเป็นอาการที่ไม่จำเพาะและไม่สามารถเจาะจงไปยังโรคหนึ่งโรคใด การวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการจึงมีความสำคัญอย่างยิ่งในการยืนยันการวินิจฉัยอาการทางคลินิก จึงเป็นที่มาของการพัฒนาชุดทดสอบที่สามารถวินิจฉัยโรคโรคสครับไทฟัสและโรคเลปโตสไปโรสิสได้รวดเร็วและถูกต้องแม่นยำ โครงการนี้ได้ผลิตต้นแบบผลิตภัณฑ์สองชิ้น คือ ชุดทดสอบแบบรวดเร็วการตรวจวินิจฉัยโรคสครับไทฟัส ชนิด IgM/IgG และชุดทดสอบแบบรวดเร็วการตรวจวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรสิส ชนิด IgM/IgG โดยวิธี Immunochromatrogaphic based gold nanoparticles test (Strip test) ซึ่งใช้ recombinant proteins เป็นแอนติเจน โดยผลิต recombinant proteins เริ่มด้วยการออกแบบไพร์เมอร์ของยีนที่ควบคุมการสร้างโปรตีนที่ต้องการ สกัดสารพันธุกรรมของเชื้อเพื่อเป็นต้นแบบจำลองยีน ด้วยเทคนิคโพลีเมอร์เรสเชนรีเอกชั่น (PCR) นำไปโคลนเข้ากับพลาสมิด หลังจากนั้นทำการคัดเลือกโคลนที่มีชิ้นส่วนของยีน ด้วยเทคนิค PCR และ restriction fragment analysis จึงได้ recombinant โคลนต่างๆ ที่มีความสามารถสร้างโปรตีน ให้ผลิตโปรตีนแล้วผ่านกระบวนการทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ โปรตีนของโรคสครับไทฟัสและโรคเลปโตสไปโรสิส คือ 56kDa proteins จากเชื้อ Orientia tsutsugamushi สายพันธุ์ (prototype strains) Karp, Kato และ Gilliam และ 25kDa [Electron transfer flavoprotein subunit beta (ETF_beta)] ตามลำดับ ในการพัฒนาชุดทดสอบการวินิจฉัยโรคสครับไทฟัส ได้ recombinant 56 kDa proteins ของทั้งสามสายพันธุ์ มีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่มีความคล้ายคลึงกับลำดับนิวคลีโอไทด์ที่อยู่ใน NCBI database เท่ากับร้อยละ 97.8, 97.7 และ 97.4 ตามลำดับ จากผลการทดสอบ immunoreactivity ชี้ว่า recombinant 56 kDa proteins สามารถใช้เป็นแอนติเจนได้ดีมากในการตรวจหาแอนติบอดีต่อทั้งสามสายพันธุ์ Karp, Kato และ Gilliam รวมทั้งสายพันธุ์ TA716 และ TA763 ได้การประเมินชุดทดสอบโรคสครับไทฟัส ชนิด IgM (Scrub_M) และ ชนิด IgG (Scrub_G) โดยใช้ immunofluorescence assay (IFA) เป็นวิธีมาตรฐาน โดยใช้เกณฑ์การพิจารณาผลบวกจากค่า titer ของ IFA_IgM/IgG (titer > 1:400) กับตัวอย่างตรวจซีรัม จำนวน 318 ตัวอย่าง ประกอบด้วย scrub typhus จำนวน 100 ตัวอย่าง และ non-scrub typhus จำนวน 218 ตัวอย่าง (leptospirosis จำนวน 53 ตัวอย่าง, dengue จำนวน 96 ตัวอย่าง, มิวรีนไทฟัส จำนวน 30 ตัวอย่าง และ โรคไม่ทราบสาเหตุ จำนวน 39 ตัวอย่าง) ค่าการประเมินชุดทดสอบ Scrub_M/G มีความไวร้อยละ 97.0 ความจำเพาะร้อยละ 100 ค่าทำนายผลบวก ร้อยละ 100 และค่าทำนายผลลบ 98.6 หากพิจารณาแยก สำหรับค่าการประเมินชุดทดสอบ Scrub_M มีความไวร้อยละ 81.0 ความจำเพาะร้อยละ100 ค่าทำนายผลบวก ร้อยละ 100 และค่าทำนายผลลบ ร้อยละ 92.0 ค่าการประเมินชุดทดสอบ Scrub_G มีความไวร้อยละ 93.0 ความจำเพาะร้อยละ100 ค่าทำนายผลบวก ร้อยละ 100 และค่าทำนายผลลบ 96.9 การประเมินชุดทดสอบโรคเลปโตสไปโรสิส ซึ่งเตรียมโดยการหยดแอนติเจนเอง (version 1) ชนิด IgM (LepProt_M) ซึ่งมี recombinant ETF protein เป็นแอนติเจน และ LepLPS_M ซึ่งมี LPS เป็นแอนติเจน กับค่า titer ของ IFA ชนิด IgM (IFA_M) ต่อ leptospirosis พบว่าในกลุ่มผลลบของ IFA_M (titer <1:50) ได้ผลลบตรงกันด้วย LepProt_M และ LepLPS_M คิดเป็นร้อยละ 43.5 สำหรับในกลุ่มผลบวกของ IFA_M titer 1:400 ถึง > 1:6400 ได้ผลบวกตรงกันด้วย LepProt_M คิดเป็นร้อยละ 44.4 (4 ใน 9 ตัวอย่าง) ตามลำดับ สำหรับ LepLPS_M ได้ผลบวกทุกตัวอย่าง สำหรับ LepProt_M และ LepProt_G ยังได้ผลไม่ดีนักแสดงว่าการตรวจหาแอนติบอดียังไม่ดีพอ สมควรที่จะปรับปรุงแก้ไข เช่น บัปเฟอร์ เมมเบรน และ conjugate เป็นต้น เมื่อทราบปัญหาจึงได้พัฒนาจนกระทั่งได้แอนติเจนที่ดีใช้ใน strip test เมื่อวิเคราะห์ผลของ LepLPS_M ได้ผลบวกเกือบทุกตัวอย่าง อาจเป็นไปได้ว่ามีความไวสูงมากหรือมีปัญหาของผลบวกปลอม จำเป็นต้องมีการทดสอบต่อไป ต่อมาได้มีการพัฒนา LepProt_M และ LepProt_G เป็น version 2 ในการประเมินชุดทดสอบ เทียบกับชุดทดสอบที่มีวางจำหน่าย SD BIOLINE Leptospira IgM/IgG (SD Lep_M/G) ซึ่งมีความไวร้อยละ 96.2 และความจำเพาะร้อยละ 95.7 จากการศึกษาพบว่า ไม่สามารถใช้ผลการแยกเชื้อเป็นวิธีมาตรฐาน อย่างไรก็ตามหากใช้ผลการแยกเชื้อเป็นวิธีมาตรฐาน พบว่า LepProt_M มีความไวสูงกว่า SD Lep_M ในด้านการตรวจหาแอนติบอดีในระยะต้นของโรค (early detection) สำหรับการใช้ผล microscopic agglutination test (MAT) ที่มีผลบวก titer > 1:400 เป็นวิธีมาตรฐาน พบว่าชุดทดสอบ LepProt_M/G มีความไว ค่าทำนายผลบวก และค่าทำนายผลลบ สูงกว่า SD_M/G ยกเว้น SD_M มีความ จำเพาะ (ร้อยละ 100) สูงกว่า LepProt_M (ร้อยละ 91.7) โดยสรุปโครงการนี้ได้ผลิตต้นแบบผลิตภัณฑ์สองชิ้น คือ ชุดทดสอบแบบรวดเร็วการตรวจวินิจฉัยโรคสครับไทฟัส ชนิด IgM/IgG และชุดทดสอบแบบรวดเร็วการตรวจวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรสิส ชนิด IgM/IgG ซึ่งมีความไว ความจำเพาะ ค่าทำนายผลบวก และค่าทำนายผลลบ ที่ดีมากสามารถวินิจฉัยโรคโรคสครับไทฟัสและโรคเลปโตสไปโรสิสได้รวดเร็วและถูกต้องแม่นยำ