บทคัดย่อ
การแสดงออกของโปรตีนก่อมะเร็ง E6 ในระดับที่สูงของเชื้อไวรัสแปปิลโลมาชนิด 16 และการมีภาวะเมธิลเลชั่นที่สูงในยีนแอลหนึ่ง จัดเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่ได้รับการยอมรับว่ามีความจำเพาะกับการที่เซลล์มีความเสี่ยงจะพัฒนาไปเป็นมะเร็งปากมดลูก งานวิจัยนี้จึงสนใจพัฒนาเทคนิคการตรวจหาโปรตีน E6 โดยใช้อนุภาคนาโนทองคำและหลักการ Immunochromatography (IC) และวิธีเอนไซม์ลิงค์อิมมูโนซอบเบนเพื่อตรวจภาวะเมธิลเลชั่นของยีนแอลหนึ่งในเซลล์ปากมดลูกทำการเคลือบอนุภาคนาโนทองคำด้วยโปรตีนจีและแอนติบอดีจำเพาะต่อโปรตีน E6 ของ HPV16 และ HPV18 แล้วนำมาทดสอบกับโปรตีนบริสุทธิ์ HPV16E6 พบว่าความเข้มข้นของโปรตีน E6 ต่ำสุดที่สามารถตรวจได้คือ 312.5 นาโนกรัม เมื่อใช้แอนติบอดีที่อยู่บนแผ่นเมมเบรนที่ความเข้มข้น 0.5 ไมโครกรัม และใช้ phosphate Buffer /0.05% Tween 20/1% BSA, pH 7.4 เป็นสารละลายให้อนุภาคนาโนทองคำมีการเคลื่อนที่ เมื่อนำมาทดสอบความจำเพาะกับโปรตีนที่สกัดจากเซลล์เพาะเลี้ยงมะเร็งปากมดลูกที่มีการติดเชื้อ HPV16 สามารถตรวจพบผลบวกที่จำนวนหนึ่งแสนเซลล์ เมื่อทดสอบกับเซลล์มะเร็งปากมดลูกที่มีการติดเชื้อ HPV ชนิดอื่นหรือเซลล์มะเร็งที่ไม่มีการติดเชื้อ HPV และแบคทีเรียชนิดต่างๆ ได้ผลลบ เมื่อนำเซลล์ปากมดลูกที่เก็บจากผู้หญิงที่มีความผิดระดับต่างๆ โดยเป็นเซลล์ปากมดลูกที่เหลือจากการตรวจงานประจำมาทำการทดสอบ พบว่าในตัวอย่างที่ไม่มีการติดเชื้อไวรัส HPV หรือมีการติดเชื้อไวรัส HPV ชนิดอื่นๆที่ไม่ใช่ HPV16 และ HPV18 ให้ผลลบทั้งหมด ในกลุ่มตัวอย่างที่มีการติดเชื้อ HPV16 พบว่าให้ผลบวกจำนวนร้อยละ 40, 22.22, 50, 28.6 และ 18.18 ตามลำดับในกลุ่มเซลล์ที่มีความผิดปกติแบบมะเร็งปากมดลูก CIN3, CIN2, CIN1 และเซลล์ที่มีการอักเสบและแบบ ASCUS ตามลำดับ สำหรับการตรวจภาวะเมธิเลชั่นของยีนแอลหนึ่ง ต้องนำดีเอ็นเอมาทำการเปลี่ยนสภาพโดยใช้น้ำยา bisulfite และใช้วิธีทางอณูชีววิทยามาตรวจหาปริมาณภาวะเมธิเลชั่นโดยวิธี pyrosequencing ผลการตรวจพบว่าในกลุ่มมะเร็งปากมดลูกมีภาวะเมธิลเลชั่นของยีนแอลหนึ่งในระดับที่สูงและพบในระดับที่ต่ำในเซลล์ระดับปกติและ CIN1 และทางผู้วิจัยยังพบว่าตรงตำแหน่ง CpGs 5600 และ 5609 มีสภาวะเมธิลเลชั่นในระดับที่สูงเมื่อเทียบกับตำแหน่งอื่นๆ หลังจากนั้นทางผู้วิจัยได้ทาการพัฒนาเทคนิค ELISA แบบ Indirect และ sandwich ELISA เพื่อตรวจภาวะเมธิลเลชั่นของยีนแอลหนึ่งโดยใช้ oligonucleotide probe ที่จำเพาะต่อไวรัส HPV16 แต่อย่างไรก็ตาม การตรวจแบบ sandwich ELISA ยังไม่ประสบผลสำเร็จ แต่เทคนิค indirect ELISA ก็ให้ค่าการวัดปฏิกิริยาการเกิดสีที่สูงมากในหลุมที่มี oligonucleotide probe แต่ไม่มีดีเอ็นเอของ HPV16 และในระบบที่ไม่มี oligonucleotide probe แต่มีน้ำยาตัวอื่นทุกตัวครบให้ค่าการวัดปฏิกิริยาการเกิดสีที่ต่ำ ทางผู้วิจัยได้ทำการหาปริมาณที่เหมาะสมของน้ำยา blocking, oligonucleotide probe, streptavidin, primary antibody (anti-5-methylacytosine) และเวลาที่ใช้ในการทำปฏิกิริยา ก็พบว่ายังไม่สามารถแก้ปัญหาการมีพื้นหลังสีที่สูงลงได้ การพัฒนาเทคนิค ELISA ในขณะนี้ยังไม่ประสบผลสาเร็จแต่ทางผู้วิจัยจะทำการทดลองต่อไปเพื่อลดพื้นหลังสีที่สูงเพื่อที่จะได้ทดสอบหาความไวและความจำเพาะต่อไป และสุดท้ายจะตรวจกับตัวอย่างดีเอ็นเอที่สกัดจากเชลล์ปากมดลูก
บทคัดย่อ
Overexpression of human papillomavirus (HPV) 16 oncogenic protein E6 and hypermethylation of HPV16 L1 gene are of interest as biomarkers for cervical cancer progression. Immunochromatography (IC) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) are widely used to detect target biomolecules in human. In this study, we developed IC and ELISA assays to detect viral oncoprotein E6 and L1 gene methylation of HPV16 in cervical cells, respectively. The conjugated gold coated with protein G and mouse monoclonal anti-HPV16E6+HPV18E6 was optimized and can detect as low as 312.5 nanogram of HPV16 E6 purified protein using 0.5 microgram of antibody to E6 coated on strip in phosphate Buffer/0.05% Tween 20/1% BSA, pH 7.4 as running buffer. Positive band can also be detected in protein extraction from cervical cell lines containing HPV16 at least 1x105 cells. Nonspecific band was not detected when other types of HPV positive cell line and HPV negative cell line as well as bacterial cell lysate were used in the assay. The remaining cervical cells samples obtained from routine laboratory were used to evaluate the performance of the developed assay. HPV negative samples or other high-risk HPV types other than HPV16 and 18 showed negative results. HPV16 positive samples showed 40%, 22.22%, 50%, 28.6% and 18.18% positive results by IC in squamous cell carcinoma, CIN3, CIN2, CIN1 and inflammation/ASCUS groups, respectively. HPV16 L1 gene methylation status was first detected using bisulfite treated DNA and pyrosequencing assay was used for quantification of methylation. Hypermethylation was detected in cervical cancer but was low in normal/CIN1 lesions. CpG sites 5600 and 5609 are highly methylated compared to other CpGs. Indirect and sandwich ELISA were developed to detect HPV16 L1 gene methylation status using specific oligonucleotide probe for HPV16, however, it was not successful in developing sandwich ELISA assay. Indirect ELISA showed high background when oligonucleotide probe was present with other reagents in the absent of HPV16 positive DNA. Other system without oligonucleotide probe in the present of all reagents revealed low background. Optimization of blocking reagents, oligonucleotide probe concentration, streptavidin concentration, anti-5-methylcytosine dilution and incubation time were not successfully reduced the background. The ELISA assay was not yet developed successfully, however, troubleshooting will be further performed to reduce the background and can be further tested for specificity and sensitivity and will be applied in clinical samples
