การหาตัวบ่งชี้ที่จำเพาะต่อผู้ป่วยมะเร็งช่องปากเพื่อพัฒนาเป็นชุดตรวจคัดกรองจากน้ำลายด้วยวิธี lateral flow Immunochromatography

Abstract

ผู้ป่วยโรคมะเร็งช่องปากมักได้รับการวินิจฉัยเมื่ออยู่ในระยะรุนแรงของโรค (advanced stage) ซึ่งส่งผลให้ผู้ป่วยเหล่านี้มีการพยากรณ์ของโรคไม่ดี (poor prognosis) ทำให้มีอัตราการเสียชีวิตสูง ดังนั้น จึงจำเป็นอย่างเร่งด่วนที่จะต้องมีการพัฒนาวิธีการตรวจโรคมะเร็งช่องปากในระยะเริ่มแรกของการเกิดโรคและวิธีการตรวจคัดกรองโรคจากกลุ่มประชากรที่มีความเสี่ยง เช่น กลุ่มที่มีการสูบบุหรี่ ดื่มสุราและการเคี้ยวหมาก รวมทั้งการติดเชื้อ human papillomavirus (HPV) และ Epstein-Barr virus (EBV) ที่มีความถูกต้อง แม่นยำ รวดเร็วและง่ายต่อการใช้จากผลการทดลองก่อนหน้านี้ ด้วยวิธี two-dimensional gel electrophoresis (2-DE gel) ทางผู้วิจัยพบว่า peroxiredoxin 2 (PRDX2) และ zinc-alpha-2-glycoprotein (ZAG หรือ AZGP1) มีระดับการแสดงออกในตัวอย่างน้ำลายที่มาจากกลุ่มผู้ป่วยมะเร็งช่องปากสูงกว่ากลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ ในการศึกษานี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจหาการแสดงออกของโปรตีน PRDX2 และ ZAG ในกลุ่มตัวอย่างน้ำลายที่ได้มาจากกลุ่มควบคุม ผู้ป่วยที่มีการอักเสบในช่องปากและผู้ป่วยที่มีรอยโรคระยะก่อนมะเร็ง (precancerous) รวมทั้งกลุ่มมะเร็งช่องปาก เพื่อยืนยันการเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพ (biomarker) ของโปรตีนดังกล่าว และทางผู้วิจัยยังศึกษาบทบาทของ PRDX2 และ ZAG ในเซลล์เพาะเลี้ยงมะเร็งช่องปากที่ยังไม่เคยมีการรายงานมาก่อน ตัวอย่างน้ำลายที่ได้มาจากกลุ่มควบคุม กลุ่มผู้ป่วยที่มีการอักเสบในช่องปาก กลุ่มผู้ป่วยที่มีรอยโรคระยะก่อนมะเร็งและกลุ่มผู้ป่วยมะเร็งช่องปาก ได้ถูกรวบรวมเพื่อใช้ในการตรวจหาระดับการแสดงออกของโปรตีน PRDX2 และ ZAG ด้วยวิธีเวสเทิร์นบลอท (western blot) และวิเคราะห์หาความไว ความจำเพาะและค่าพื้นที่ใต้เส้นโค้ง (area under the curve, AUC) สำหรับการศึกษาหน้าที่ของ PRDX2 และ ZAG เซลล์ ORL-48T ได้ถูกติดเชื้อด้วยรีโทรไวรัส (retrovirus) ที่บรรจุพลาสมิด pCLXSN-PRDX2 และ pCLXSN-ZAG จากนั้นนำเซลล์ที่ผ่านการคัดเลือกโคลนด้วยยาจีนีติซินหรือจี 418 (geneticin หรือ G-418) จากนั้นนำโคลนที่ได้ไปวิเคราะห์การวัดการเพิ่มจำนวนของเซลล์ (cell proliferation) วัฏจักรของเซลล์ (cell-cycle progression) การตายแบบอะพอพโทซิส (apoptosis) และการเคลื่อนที่ของเซลล์ (cell migration) ด้วยวิธีเอ็มทีที (MTT assay) โฟลวไซโทเมตรีที่ย้อมเซลล์ด้วยสาร propidium iodide โฟลวไซโทเมตรีที่ย้อมเซลล์ด้วยสาร annexin V และ propidium iodideapoptosis และการสมานแผล ตามลำดับ ผลการทดลองพบว่า ปริมาณ PRDX2 ในตัวอย่างน้ำลายที่ได้มาจากกลุ่มผู้ป่วยที่มีรอยโรคระยะก่อนมะเร็งและมะเร็งช่องปากมีค่าอัตราการแสดงออกสัมพัทธ์ (relative expression) แตกต่างจากกลุ่มควบคุมและกลุ่มช่องปากอักเสบอย่างมีนัยสำคัญ ขณะที่ปริมาณ ZAG ในน้ำลายเฉพาะในกลุ่มมะเร็งช่องปากมีค่า relative expression แตกต่างจากกลุ่มควบคุมและกลุ่มช่องปากอักเสบอย่างมีนัยสำคัญ ผลการวิเคราะห์จากในตัวอย่างระยะก่อนเป็นมะเร็งและในกลุ่มมะเร็งช่องปาก มีค่า AUC ของ PRDX2 เท่ากับ 0.8661 และ 0.9521 ในขณะที่การแสดงออกของ ZAG มีค่า AUC เท่ากับ 0.8832 และ 0.8494 เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมตามลำดับ แต่เมื่อเปรียบเทียบกับน้ำลายของกลุ่มช่องปากอักเสบ จะมีค่า AUC ของ PRDX2 เท่ากับ 0.8512 และ 0.8543 ตามลำดับ ซึ่งสามารถจำแนกได้ดีกว่าการตรวจหาระดับการแสดงออกของ ZAG ที่มีค่า AUC เท่ากับ 0.7752 และ 0.7848 ตามลำดับ จากผลการทดลองนี้ แสดงให้เห็นว่า เฉพาะ PRDX2 สามารถใช้จำแนกโรคระยะก่อนเป็นมะเร็งและมะเร็งช่องปากออกจากกลุ่มควบคุมและกลุ่มช่องปากอักเสบได้ นอกจากนี้ ผู้วิจัยพบว่าการใช้ระดับการแสดงออกร่วมกัน (combination) ของ PRDX2 และ ZAG จะทำให้การจำแนกกลุ่มระยะก่อนเป็นมะเร็งและมะเร็งช่องปากออกจากกลุ่มอักเสบได้ดีขึ้น โดยให้ค่า AUC เท่ากับ 0.8002 และ 0.8570 ตามลำดับ สำหรับการศึกษาหน้าที่ของ PRDX2 ในเซลล์เพาะเลี้ยงมะเร็งช่องปาก ORL-48T พบว่า เซลล์ ORL-48T ที่ถูกติดเชื้อด้วยเชื้อไวรัส retrovirus ที่บรรจุพลาสมิด pCLXSN-PRDX2 มีสัดส่วนของการเกิด cell proliferation, cell-cycle progression และ cell migration สูงกว่าเซลล์ ORL-48T ที่ถูกติดเชื้อด้วยไวรัส retrovirus ที่บรรจุพลาสมิด pCLXSN (เซลล์ control) แต่ลดจำนวน apoptotic cells อย่างมีนัยสำคัญ สำหรับการศึกษาหน้าที่ของ ZAG ในเซลล์เพาะเลี้ยงมะเร็งช่องปาก ORL-48T พบว่า เซลล์ ORL-48T ที่ถูกติดเชื้อด้วยไวรัส retrovirus ที่บรรจุพลาสมิด pCLXSN-ZAG มีสัดส่วนของการเกิด cell-cycle progression และ cell migration ไม่แตกต่างจากเซลล์ ORL-48T ที่ถูกติดเชื้อด้วยไวรัส retrovirus ที่บรรจุพลาสมิด pCLXSN (เซลล์ control) แต่ลดสัดส่วนของ cell proliferation และเพิ่ม apoptotic cells โดยเฉพาะอะพอพโทซิสระยะท้าย (late apoptosis) อย่างมีนัยสำคัญ ผลการทดลองเหล่านี้ แสดงให้เห็นว่า PRDX2 ทำหน้าที่ในการส่งเสริมการพัฒนาของมะเร็งช่องปาก ในขณะที่ ZAG มีบทบาทในการกระตุ้น late apoptosis ในเซลล์มะเร็งช่องปากและการแสดงออก PRDX2 สามารถใช้เป็น biomarker เพื่อจำแนกโรคระยะก่อนเป็นมะเร็งและมะเร็งช่องปากออกจากกลุ่มควบคุมและกลุ่มอักเสบในช่องปากได้ ขณะที่การแสดงออกร่วมกันของ PRDX2 และ ZAG ในน้ำลาย สามารถใช้เป็น biomarker เพื่อเพิ่มความไวในการจำแนกโรคระยะก่อนเป็นมะเร็งและมะเร็งช่องปากออกจากกลุ่มอักเสบในช่องปากและการศึกษานี้จะนำไปต่อยอดเพื่อพัฒนาวิธีการตรวจคัดกรองโรคมะเร็งต่อไป