การวิจัยเพื่อคิดค้นและพัฒนาเทคนิคใหม่ในการตรวจหารอยโรคก่อมะเร็งปากมดลูกระยะเริ่มต้นและโรคที่เกี่ยวข้องกับการติดเชื้อไวรัสแปปิโลมา

Abstract

การแสดงออกของโปรตีนก่อมะเร็ง E6 ในระดับที่สูงของเชื้อไวรัสแปปิลโลมาชนิด 16 และการมีภาวะเมธิลเลชั่นที่สูงในยีนแอลหนึ่ง จัดเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่ได้รับการยอมรับว่ามีความจำเพาะกับการที่เซลล์มีความเสี่ยงจะพัฒนาไปเป็นมะเร็งปากมดลูก งานวิจัยนี้จึงสนใจพัฒนาเทคนิคการตรวจหาโปรตีน E6 โดยใช้อนุภาคนาโนทองคำและหลักการ Immunochromatography (IC) และวิธีเอนไซม์ลิงค์อิมมูโนซอบเบนเพื่อตรวจภาวะเมธิลเลชั่นของยีนแอลหนึ่งในเซลล์ปากมดลูกทำการเคลือบอนุภาคนาโนทองคำด้วยโปรตีนจีและแอนติบอดีจำเพาะต่อโปรตีน E6 ของ HPV16 และ HPV18 แล้วนำมาทดสอบกับโปรตีนบริสุทธิ์ HPV16E6 พบว่าความเข้มข้นของโปรตีน E6 ต่ำสุดที่สามารถตรวจได้คือ 312.5 นาโนกรัม เมื่อใช้แอนติบอดีที่อยู่บนแผ่นเมมเบรนที่ความเข้มข้น 0.5 ไมโครกรัม และใช้ phosphate Buffer /0.05% Tween 20/1% BSA, pH 7.4 เป็นสารละลายให้อนุภาคนาโนทองคำมีการเคลื่อนที่ เมื่อนำมาทดสอบความจำเพาะกับโปรตีนที่สกัดจากเซลล์เพาะเลี้ยงมะเร็งปากมดลูกที่มีการติดเชื้อ HPV16 สามารถตรวจพบผลบวกที่จำนวนหนึ่งแสนเซลล์ เมื่อทดสอบกับเซลล์มะเร็งปากมดลูกที่มีการติดเชื้อ HPV ชนิดอื่นหรือเซลล์มะเร็งที่ไม่มีการติดเชื้อ HPV และแบคทีเรียชนิดต่างๆ ได้ผลลบ เมื่อนำเซลล์ปากมดลูกที่เก็บจากผู้หญิงที่มีความผิดระดับต่างๆ โดยเป็นเซลล์ปากมดลูกที่เหลือจากการตรวจงานประจำมาทำการทดสอบ พบว่าในตัวอย่างที่ไม่มีการติดเชื้อไวรัส HPV หรือมีการติดเชื้อไวรัส HPV ชนิดอื่นๆที่ไม่ใช่ HPV16 และ HPV18 ให้ผลลบทั้งหมด ในกลุ่มตัวอย่างที่มีการติดเชื้อ HPV16 พบว่าให้ผลบวกจำนวนร้อยละ 40, 22.22, 50, 28.6 และ 18.18 ตามลำดับในกลุ่มเซลล์ที่มีความผิดปกติแบบมะเร็งปากมดลูก CIN3, CIN2, CIN1 และเซลล์ที่มีการอักเสบและแบบ ASCUS ตามลำดับ สำหรับการตรวจภาวะเมธิเลชั่นของยีนแอลหนึ่ง ต้องนำดีเอ็นเอมาทำการเปลี่ยนสภาพโดยใช้น้ำยา bisulfite และใช้วิธีทางอณูชีววิทยามาตรวจหาปริมาณภาวะเมธิเลชั่นโดยวิธี pyrosequencing ผลการตรวจพบว่าในกลุ่มมะเร็งปากมดลูกมีภาวะเมธิลเลชั่นของยีนแอลหนึ่งในระดับที่สูงและพบในระดับที่ต่ำในเซลล์ระดับปกติและ CIN1 และทางผู้วิจัยยังพบว่าตรงตำแหน่ง CpGs 5600 และ 5609 มีสภาวะเมธิลเลชั่นในระดับที่สูงเมื่อเทียบกับตำแหน่งอื่นๆ หลังจากนั้นทางผู้วิจัยได้ทาการพัฒนาเทคนิค ELISA แบบ Indirect และ sandwich ELISA เพื่อตรวจภาวะเมธิลเลชั่นของยีนแอลหนึ่งโดยใช้ oligonucleotide probe ที่จำเพาะต่อไวรัส HPV16 แต่อย่างไรก็ตาม การตรวจแบบ sandwich ELISA ยังไม่ประสบผลสำเร็จ แต่เทคนิค indirect ELISA ก็ให้ค่าการวัดปฏิกิริยาการเกิดสีที่สูงมากในหลุมที่มี oligonucleotide probe แต่ไม่มีดีเอ็นเอของ HPV16 และในระบบที่ไม่มี oligonucleotide probe แต่มีน้ำยาตัวอื่นทุกตัวครบให้ค่าการวัดปฏิกิริยาการเกิดสีที่ต่ำ ทางผู้วิจัยได้ทำการหาปริมาณที่เหมาะสมของน้ำยา blocking, oligonucleotide probe, streptavidin, primary antibody (anti-5-methylacytosine) และเวลาที่ใช้ในการทำปฏิกิริยา ก็พบว่ายังไม่สามารถแก้ปัญหาการมีพื้นหลังสีที่สูงลงได้ การพัฒนาเทคนิค ELISA ในขณะนี้ยังไม่ประสบผลสาเร็จแต่ทางผู้วิจัยจะทำการทดลองต่อไปเพื่อลดพื้นหลังสีที่สูงเพื่อที่จะได้ทดสอบหาความไวและความจำเพาะต่อไป และสุดท้ายจะตรวจกับตัวอย่างดีเอ็นเอที่สกัดจากเชลล์ปากมดลูก