บทคัดย่อ
มะเร็งต่อมลูกหมากเป็นมะเร็งที่พบบ่อยในเพศชาย ปัจจุบันวิธีตรวจคัดกรองมะเร็งต่อมลูกหมากที่นิยมใช้อย่างแพร่หลาย คือ การตรวจระดับ prostate specific antigen (PSA) ในซีรั่ม แต่การใช้ค่า PSA เพียงอย่างเดียวมีข้อเสีย เนื่องจาก PSA ไม่จำเพาะกับมะเร็งต่อมลูกหมาก เมื่อเร็วๆ นี้ได้มีการศึกษาและค้นพบตัวบ่งชี้ทางชีวภาพหลายชนิดที่สามารถใช้ในการช่วยวินิจฉัยมะเร็งต่อมลูกหมากให้มีความถูกต้องและแม่นยำยิ่งขึ้น ในการวิจัยครั้งนี้ ได้มีการพัฒนาวิธีการตรวจวิเคราะห์ sarcosine รวมทั้งระดับการแสดงออกของยีน PCA3 ในปัสสาวะ เพื่อใช้ในการตรวจคัดกรองและวินิจฉัยมะเร็งต่อมลูกหมาก โดยวิธีที่ใช้ใน การตรวจวิเคราะห์ sarcosine คือ enzyme-coupled colorimetric assay ซึ่งเป็นวิธีที่อาศัยเอนไซม์ sarcosine oxidase (SOX) และเอนไซม์ horseradish peroxidase วิธีนี้สามารถทำใน 96-well microtiter plate โดยวัดค่าดูดกลืนแสงที่ 570 nm ทั้งนี้ได้มีการหาสภาวะ เช่น pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมที่สุดในการทำปฏิกิริยา โดยในสภาวะดังกล่าวจะได้ค่า limit of detection (LOD) และ limit of quantification (LOQ) เท่ากับ 0.7 และ 1 μM ตามลำดับ รวมทั้งค่า linearity ที่ correlation of coefficient เท่ากับ 0.990 นอกจากนี้ ยังพบว่าวิธีที่พัฒนาขึ้นจำเพาะต่อ sarcosine และไม่ถูกรบกวนปฏิกิริยาด้วย ascorbic acid, glucose และ bilirubin เมื่อตรวจสอบความใช้ได้ของวิธีกับ sarcosine ที่เติมลงไปในปัสสาวะจริง พบว่าวิธีที่พัฒนาขึ้นมีความถูกต้องและแม่นยำค่อนข้างสูง วิธีนี้สามารถใช้วิเคราะห์ระดับ sarcosine ในปัสสาวะของผู้ป่วยมะเร็งต่อมลูกหมาก ผู้ป่วยโรคต่อมลูกหมากโตและคนปกติซึ่งมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญได้ สำหรับวิธีที่ใช้ในการตรวจระดับการแสดงออกของยีน PCA3 ในปัสสาวะ คือ gold nanoparticle-based colorimetric assay ซึ่งเป็นวิธีที่อาศัย PCR product ที่ติดฉลากด้วยหมู่ thiol ปลายด้าน 5’ มาทำปฏิกิริยากับอนุภาคนาโนทองคำ (AuNPs) โดย PCR product จะถูกตรึงอยู่บน AuNPs จากนั้น เมื่อเติมสารละลาย NaCl ที่ความเข้มข้นสูง PCR product จะยับยั้งไม่ให้โมเลกุลของ AuNPs เข้าใกล้กันและตกตะกอน (aggregation) โดยสามารถติดตามปฏิกิริยาการเปลี่ยนสีที่เกิดขึ้นได้ด้วยตาเปล่าหรือใช้สัดส่วนการดูดกลืนแสงที่ 520/640 nm วิธีนี้สามารถทำได้ใน 96-well microtiter plate ทั้งนี้ในสภาวะที่เหมาะสม เมื่อมี PCR product ที่มีหมู่ thiol ในปฏิกิริยาจะได้ค่าสัดส่วนการดูดกลืนแสง (520/640) มากกว่า 1.5 วิธีนี้ยังมีความจำเพาะสูงต่อเซลล์มะเร็งต่อมลูกหมาก ที่มีการแสดงออกของยีน PCA3 ขณะที่เซลล์อื่นๆ ไม่พบ PCR product และให้ผลเป็นลบ นอกจากนี้ ความไวของการทดสอบ (sensitivity) มีค่าเท่ากับ 31.25 ng ของ PCR product โดยสรุปการวิจัยครั้งนี้ สามารถพัฒนาวิธีในการตรวจวิเคราะห์ sarcosine และ PCA3 ในปัสสาวะที่ง่าย รวดเร็ว มีความจำเพาะและสามารถนำมาใช้ในการตรวจคัดกรองและวินิจฉัยมะเร็งต่อมลูกหมากได้สำเร็จ
บทคัดย่อ
Prostate cancer (PCa) is one of the most common cancers among men. Presently, a screening test for PCa is based on serum prostate specific antigen (PSA) level. However, PSA level is not a specific biomarker for PCa. Recently, several potential biomarkers of PCa have been discovered. In this study, detection methods for sarcosine and PCA3 in urine have been developed for PCa screening and diagnosis. An enzyme-coupled colorimetric method was proposed for sarcosine assay. This method is a specific reaction based on sarcosine oxidase (SOX) and horseradish peroxidase (HRP). The method was performed in the 96-well microtiter plate and measured spectrophotometrically (OD570). At the optimum conditions, the limit of detection (LOD) and quantification (LOQ) were found to be 0.7 and 1 μM, respectively. A good linearity was revealed with a coefficient of 0.990. The assay showed no significant interference from ascorbic acid, glucose and bilirubin. In addition, it is extremely specific for sarcosine rather than other amino acids. The determination of sarcosine in human urine displayed high accuracy and good reproducibility. This method is promising to differentiate among prostate cancer patients, benign prostatic hyperplasia patients and healthy subjects according to urinary sarcosine level. Simultaneously, a gold nanoparticle-based colorimetric assay was also achieved for PCA3 detection. The assay used the property of thiol group on the 5’-end of the PCR product to simply immobilize onto the surface of gold nanoparticles (AuNPs), which can be able to prevent self-aggregation of AuNPs under high concentration of NaCl solution. Our assay can distinguish the positive from negative results by the naked eye observation of color change or using the ratio of the absorbance at 520 and 640 nm (A520/640). This method was also performed in the 96-well microtiter plate. At the optimum conditions, the optimal ratio (520/640) was > 1.5 in the presence of thiolated PCR product. The sensitivity of assay was approximately 31.25 ng of PCR product. In addition, the assay showed significantly specific for prostate cancer cell lines, which PCA3 is highly expressed, while the other cell types showed no PCR product. Altogether, this study provides the rapid, simple and specific tools to determine urinary sarcosine and PCA3 which could be useful for prostate cancer screening and diagnosis.
