บทคัดย่อ
การวิจัยนี้เป็นการพัฒนาวิธีการตรวจหาเซลล์มะเร็งจากเลือดของผู้ป่วยมะเร็ง ที่มารับการรักษาที่โรงพยาบาลมหาวิทยาลัยนเรศวร มีวัตถุประสงค์เพื่อใช้เป็นการตรวจเพื่อคัดกรองหรือตรวจติดตามผู้ป่วยมะเร็ง ใช้วิธีการเจาะเลือดจากหลอดเลือดดำของผู้ป่วยประมาณ 10 มิลลิลิตร นำมาทำให้เม็ดเลือดแดงแตกและคัดแยกเม็ดเลือดขาวออกไปจำนวนหนึ่ง ให้คงเหลือเซลล์ที่แยกได้นำมาเก็บตรึงอยู่บนกระจกสไลด์ด้วยอุณหภูมิต่ำด้วยน้ำยาจากผู้ผลิตจำหน่าย ซึ่งน่าจะเป็นเทคนิคที่ช่วยทำให้เซลล์ที่ถูกตรึงอยู่บนกระจกสไลด์มีลักษณะของเซลล์สวยงามและสามารถเก็บรักษาไว้ในตู้เย็นได้นานหลายเดือนโดยที่สีย้อมยังคงสภาพดี ผู้วิจัยได้ทำการทดลองเก็บตัวอย่างเลือดจากผู้ป่วยที่เป็นมะเร็งลำไส้ใหญ่มาแล้ว 25 ราย และผู้ที่ได้รับการตรวจคัดกรองมะเร็งลำไส้ใหญ่ด้วยการส่องกล้อง colonoscope แล้วไม่พบความผิดปรกติ 12 ราย นอกจากนี้แม้ว่าในระยะแรกของการวิจัย คณะผู้วิจัยได้ทดลองเก็บเลือดจากคนปกติที่ไม่มีประวัติการเจ็บป่วยด้วยโรคมะเร็ง 2 ราย ผู้ป่วยมะเร็งเต้านม 2 ราย มะเร็งตับ 5 ราย มะเร็งท่อน้ำดี 1 ราย มะเร็งปอด 1 ราย และมะเร็งกระดูก 1 ราย โดยทำการย้อมแอนติบอดีต่อโปรตีน vimentin, cytokeratin, CD45, CDX2, CD31 และ CD34 ซึ่งจัดหาจากบริษัทผู้ผลิตต่าง ๆ เนื่องจากปัญหาในการทำลายเม็ดเลือดแดง ทำให้การย้อมเซลล์ไม่ได้ผลดี ผู้วิจัยจึงปรับปรุงสภาวะการทดลองใหม่เพื่อแก้ปัญหาดังกล่าว ตลอดจนการปรับสภาวะการทดลองเรื่องการรักษาอุณหภูมิต่ำในขั้นตอนต่าง ๆ และการใช้แอนติบอดีที่ความเข้มข้นต่าง ๆ กัน และการตรวจดูด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง แล้วตรวจเฉพาะรายที่เป็นมะเร็งลำไส้ใหญ่ ผลสำเร็จส่วนหนึ่งในการย้อมสไลด์เซลล์คือมองเห็นเซลล์ที่ย้อมติดแอนติบอดีเรืองแสงซึ่งส่วนใหญ่เป็นเม็ดเลือดขาวและพยาธิแพทย์ได้เป็นผู้ตรวจผลการย้อมเซลล์ ผลการตรวจหาเซลล์ที่ผิดปกติพบว่า มีอาสาสมัครที่เป็นมะเร็งลำไส้ใหญ่เพียง 2 ราย ในจำนวนทั้งหมด 25 ราย ที่พบว่ามีเซลล์ที่มีลักษณะผิดปกติหรืออาจเป็นเซลล์มะเร็งคือเซลล์มีขนาดใหญ่ มีนิวเคลียสใหญ่กว่าเซลล์เม็ดเลือดขาวและย้อมติดแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อโปรตีน CK20 และ CDX2 ซึ่ง CDX2 มีรายงานการวิจัยจากต่างประเทศว่ามีความจำเพาะต่อเซลล์ชนิด adenocarcinoma อย่างไรก็ตาม จากการตรวจด้วยวิธีการนี้ ในหลายรายพบว่ามีเซลล์ที่มีลักษณะผิดปกติแต่เนื่องจากเซลล์มีขนาดเล็กหรือใกล้เคียงเม็ดเลือดขาว จึงอาจสรุปได้ว่า จากโครงการวิจัยนี้ ตรวจพบเซลล์ที่ผิดปกติจากผู้ป่วยมะเร็งลำไส้ใหญ่ เพียง 2 ราย และอาจพบเซลล์ที่มีลักษณะผิดปกติหรือไม่แน่ใจ ได้ในผู้ป่วยและผู้ที่ตรวจไม่พบมะเร็ง ประกอบกับมีค่าใช้จ่ายในการปั่นแยกและเก็บย้อมเซลล์ค่อนข้างสูงมาก วิธีการนี้จึงยังไม่เหมาะที่จะใช้เป็นการตรวจคัดกรองมะเร็งลำไส้ใหญ่
บทคัดย่อ
The present study was aimed to develop a method to detect cancer cells in venous blood of cancer patients, either for screening for following-up. Heparinized venous whole blood of about 10 milliliters from the subjects were processed for red blood cell lysis and white blood cell depletion. The cells remained were cryo-fixed and stained using commercially available reagents claimed to give a good morphology of the fixed cells that could be stored for many months. Blood samples were collected from 25 colon cancer patients and 12 subjects who were negative for colon cancer screened by colonoscopy. Early in the study, blood samples from 2 breast cancer patients, 5 hepatocellular carcinoma patients, 1 cholangiocarcinoma patient, 1 lung cancer patient and 1 osteosarcoma patient were also collected. Antibodies against vimentin, cytokeratin, CD45, CDX2, CD31 and CD34 were used. Due to a technical problem on red blood cell lysis and staining temperature, a few weeks were spent to solve it and later cells could be fixed and stained at low temperature. Other optimizations included low temperature handling steps and concentrations of antibodies. The immuno-stained cells appeared mostly to be white blood cells of good morphology. A pathologist had investigated the stained samples and found that there were only 2 cases out of 25 colon cancer patients that seemed to have some abnormal/cancer cells. These were larger and their neclei were also bigger than the nearby white blood cells. They were especially positive for CK 20 and CDX2, the latter being reported to be specific for adenocarcinoma. However, the size of many abnormally stained cells found in many cases was similar to white blood cells, it may be concluded that in this present study abnormal cells could be found in blood samples of colon cancer patients but perhaps with a very low sensitivity. Also owing to quite a high cost of reagents for cell isolation and low temperature processing, this method at the moment could not be used as a routine colon cancer screening.
