การพัฒนาชุดตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีนนิวคลีโอฟอสมินในผู้ป่วยโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวเฉียบพลันชนิดมัยอีลอยด์เพื่อการรักษาอย่างแม่นยำ

Abstract

การกลายพันธุ์ (mutation) ของยีนนิวคลีโอฟอสมิน (nucleophosmin; NPM1) เป็นการเปลี่ยนแปลงในระดับโมเลกุลที่พบมากที่สุดในโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวเฉียบพลันชนิดมัยอีลอยด์ (acute myelogenous leukemia; AML) โดยเฉพาะในผู้ป่วยที่มีจำนวนและลักษณะโครโมโซมปกติ (normal karyotype) นอกจากนี้การกลายพันธุ์ของยีน NPM1 ยังเป็นตัวบ่งชี้ที่ดีสำหรับการพยากรณ์โรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวเฉียบพลันชนิดมัยอีลอยด์ ดังนั้นการตรวจพบการกลายพันธุ์ของยีนจึงมีความสำคัญในการพยากรณ์ความเสี่ยงและการตัดสินใจของแพทย์ใช้ในการวางแผนการรักษาผู้ป่วย การศึกษาในครั้งนี้ได้ทำการพัฒนาชุดน้ำยาที่สามารถตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน NPM1 และสามารถตรวจการกลายพันธุ์ได้พร้อมกัน ภายในปฏิกิริยาเดียวถึง 4 ชนิด (mutation type A, B, D และ J) ด้วยเทคนิค Enhanced-improved and complete enrichment-co amplification at lower denaturation temperature-polymerase chain reaction (E-ice-COLD-PCR) ร่วมกับเทคนิค High-resolution melting (HRM) analysis วิธีการทดลอง: เทคนิค E-ice-COLD-PCR จะอาศัย blocker probe ที่จับได้จำเพาะกับ wild-type แต่จับกับ mutant แบบไม่จำเพาะ เมื่อเพิ่มอุณหภูมิไปที่ critical temperature (Tc) เฉพาะ blocker probe-mutant เท่านั้นที่จะถูกแยก ทำให้สามารถเพิ่มจำนวนได้เฉพาะ mutant โดยใช้ DNA template ที่ความเข้มข้น 5 นาโนกรัม ในน้ำยาที่มีส่วนผสมดังนี้ 2x NPM1 HRM master mix ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 1x, NPM-LNA Probe ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 400 นาโนโมลาร์ และปรับปริมาตรสุดท้ายให้ครบ 25 ไมโครลิตรด้วยน้ำกลั่น จากนั้นทำปฏิกิริยา ดังนี้ initial denaturation ที่ 95°C เวลา 3 นาที หลังจากนั้นตามด้วย denaturation ที่ 95°C 5 วินาที probe hybridization step ที่ 70°C เป็นเวลา 30 วินาที ตามด้วย critical temperature ที่อุณหภูมิ 88°C เป็นเวลา 40 วินาที primer annealing ที่ 60°C เป็นเวลา 10 วินาที และ extension ที่ 72°C 30 วินาที ทำซ้ำ 40 รอบ สุดท้ายตามด้วย final extension ที่ 72°C เป็นเวลา 3 นาที หลังจากนั้นทำ melting curve analysis โดยค่อยๆ เพิ่มอุณหภูมิทีละ 2°C จากอุณหภูมิ 65°C จนถึง 85°C ด้วยเครื่อง Realtime-PCR หรือ conventional PCR machine ซึ่งตัวอย่างของการศึกษานี้ใช้ตัวอย่างเลือดจากผู้ป่วยโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาว จำนวน 83 ตัวอย่าง จากโรงพยาบาลมหาราชนครเชียงใหม่ ทำการเปรียบเทียบผลการตรวจด้วยชุดน้ำยา NPM1 HRM master mix ด้วยเทคนิค E-ice-COLD-PCR กับวิธี standard PCR และวิธี direct sequencing ผลการทดลอง: จากผลการศึกษาพบว่าชุดน้ำยา 2x NPM1 HRM master mix ให้ผลความไวและความจำเพาะเทียบเท่ากับวิธี direct sequencing โดยพบการกลายพันธุ์ของยีน NPM1 ในผู้ป่วย 9 ราย จากทั้งหมด 83 ราย นอกจากนั้นเมื่อทำการยืนยันการกลายพันธุ์ของยีน ด้วยวิธี direct sequencing โดยใช้ PCR product จากวิธี E-ice-COLD-PCR พบว่าผล sequencing ในตัวอย่างทั้ง 9 ราย มีความสอดคล้องกับวิธี E-ice-COLD-PCR รวมทั้งสามารถแปลผลได้ง่าย โดยให้ผลเป็น type A mutation แต่เมื่อใช้ PCR product จากวิธี standard PCR พบว่าให้ผลบวกในผู้ป่วย เพียง 8 ราย เนื่องจากในตัวอย่างมีสัดส่วนของการกลายพันธุ์ของยีนต่ำ ทำให้ PCR product ของยีนที่มีการกลายพันธุ์ถูกบดบังด้วย PCR product ของ wild-type และรบกวนการอ่านผลของวิธี direct sequencing ดังนั้นการทำ E-ice-COLD-PCR ก่อนยืนยันผลด้วยวิธี direct sequencing จึงสามารถเพิ่มความไวของวิธี direct sequencing ได้ สรุปผลการทดลอง: จากการเปรียบเทียบระหว่างวิธี standard PCR และวิธี direct sequencing กับชุดน้ำยา 2x NPM1 HRM master mix สามารถสรุปได้ว่าเทคนิคการตรวจและชุดน้ำยา 2x NPM1 HRM master mix ที่พัฒนาขึ้นตรวจหาการกลายพันธุ์ได้ครอบคลุมทั้ง 4 ชนิด ภายในปฏิกิริยาเดียว รวมทั้งสามารถใช้กับทั้งเครื่อง real-time PCR และ conventional PCR ได้ และยิ่งไปกว่านั้นสามารถตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน NPM1 ปริมาณต่ำได้ ในกรณีที่มี background ของ wild-type สูงและให้ผลที่น่าเชื่อถือ สามารถนำไปใช้ตรวจหาการกลายพันธุ์ NPM1 ได้ในโรงพยาบาลที่มีการวินิจฉัยและรักษาผู้ป่วย AML ซึ่งไม่ต้องอาศัยเครื่องมือที่มีราคาแพง และผู้ชำนาญการในการทำหรือแปลผล