บทคัดย่อ
จุดประสงค์ของงานวิจัยนี้เพื่ออธิบายลักษณะและประเมินผลที่เป็นนวัตกรรมใหม่ของสารสกัดจากสมุนไพรไทย ซึ่งก็คือ สารสกัดแอนโดรกราโฟไลด์ หรือ Andrographolide (AG) ต่อแผ่นไขมันกระดูกสะบ้าเหนือเข่าของผู้ป่วยโรคข้ออักเสบ รวมไปถึงการพัฒนาและปรับตำรับของสารสกัดแอนโดรกราโฟไลด์ให้เหมาะสมโดยใช้ตัวพาพอลิแลคทิกโคไกลโคลิกแอซิด (พีแอลจีเอ) หรือ Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) ร่วมกับเจลาตินไฮโดรเจล แผ่นไขมันกระดูกสะบ้าเหนือเข่าถูกสกัดเอาสเต็มเซลล์ออกมาด้วยวิธีการย่อยโดยใช้เอมไซม์ จากนั้นเพาะเลี้ยงสเต็มเซลล์และวิเคราะห์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงเพื่อดูลักษณะรูปร่างและการเพิ่มจำนวนของสเต็มเซลล์ นำสเต็มเซลล์ที่ได้มาทดสอบกับสารสกัดแอนโดรกราโฟไลด์ เพื่ออธิบายลักษณะในหลอดทดลองที่เกิดขึ้น เช่น โปรตีนที่ผิวเซลล์ การแสดงออกของยีนและความสามารถในการเปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์กระดูก เซลล์ไขมันและเซลล์กระดูกอ่อนภายใต้สภาวะที่เหมาะสมต่อไป โดยเปรียบเทียบกับช่องที่ไม่มีสารสกัดแอนโดรกราโฟไลด์ซึ่งเป็นกลุ่มควบคุม อาหารที่ใช้เลี้ยงสเต็มเซลล์แสดงถึงรูปร่างเซลล์ที่มีลักษณะเดียวกันและการแบ่งตัวของเซลล์ที่ดี โดยที่มีการแสดงออกของโปรตีนที่ผิวเซลล์ คือ ซีดี29 ซีดี73 และซีดี105 และปฏิเสธการแสดงออกของโปรตีนที่ผิวเซลล์เกี่ยวกับเซลล์เม็ดเลือด คือ ซีดี34 และ ซีดี45 นอกจากนี้ยังมีการแสดงออกในเชิงบวกของการย้อมสีที่มีความจำเพาะ คือ สีย้อมอะลิซีริน เรด เอส สำหรับเซลล์กระดูก ออยเรดโอ สำหรับเซลล์ไขมัน โทลูอิดีน บูล และอัลเชี่ยน บูล สำหรับเซลล์กระดูกอ่อน ขณะที่ความเข้มข้นของสารสกัดแอนโดรกราโฟไลด์ที่ไม่เป็นพิษและปลอดภัยสำหรับสเต็มเซลล์ ความเข้มข้นน้อยกว่า 12.5 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร สิ่งที่น่าสนใจที่เกิดขึ้นในการศึกษานี้ คือ สารสกัดแอนโดรกราโฟไลด์มีผลเหนี่ยวนำสเต็มเซลล์ให้เปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์กระดูกและเซลล์กระดูกอ่อนอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ซึ่งสอดคล้องกับการแสดงออกเชิงบวกของการย้อมสีที่มีความจำเพาะ คือ สีย้อมอะลิซีริน เรด เอส โทลูอิดีน บูล และอัลเชี่ยน บูล ต่อเซลล์กระดูก และเซลล์กระดูกอ่อน ตามลำดับ นอกจากนี้ สารสกัดแอนโดรกราโฟไลด์สามารถเพิ่มการแสดงออกของยีน รันเอ็กซ์ทู ออสทีโอพอนติน ที่สัมพันธ์กับการเจริญไปเป็นเซลล์กระดูก ซ๊อคนาย และแอคกรีแคน ที่สัมพันธ์กับการเจริญไปเป็นเซลล์กระดูกอ่อน ในทางกลับกันนั้น สารสกัดแอนโดรกราโฟไลด์มีผลยับยั้งการเปลี่ยนแปลงของสเต็มเซลล์ไปเป็นเซลล์ไขมันโดยการแสดงออกในเชิงลดลงของการย้อมสีที่มีความจำเพาะ คือ สีย้อมออยเรดโอ รวมไปถึงการแสดงออกของยีน พีพาร์แกรมม่าทู และไลโปโปรตีน ไลเปส ที่สัมพันธ์กับการเจริญไปเป็นเซลล์ไขมัน อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ สำหรับคุณสมบัติในการรักษา พบว่า สารสกัดแอนโดรกราโฟไลด์ที่ถูกเตรียมอยู่ในระดับอนุภาคนาโนด้วยวิธีเตรียมอิมัลชันเดี่ยวและระเหยตัวทำละลายออกภายหลัง และนำไปศึกษาการปลดปล่อยในหลอดทดลอง ผลที่ได้ คือ สารสกัดแอนโดรกราโฟไลด์ค่อยๆ ปลดปล่อยออกมาเป็นเวลามากกว่า 1 เดือน และเมื่อนำสารสกัดแอนโดรกราโฟไลด์ที่ถูกเตรียมอยู่ในระดับอนุภาคนำไปรวมกับเจลาตินไฮโดรเจลอีกหนึ่งชั้น พบว่า สามารถอยู่ในรูปแบบออกฤทธิ์เนิ่นนานได้เกือบสองเดือน ในชนิดของเจลาตินไฮโดรเจลแบบฝังและมากกว่าสองเดือนในชนิดของเจลาตินไฮโดรเจลแบบฉีด ซึ่งเป็นนวัตกรรมใหม่สำหรับการรักษาเฉพาะที่ในโรคข้อเข่าเสื่อม ดังนั้น สารสกัดแอนโดรกราโฟไลด์จึงมีศักยภาพที่ดีในการเป็นสารสกัดที่ได้มาจากแหล่งธรรมชาติสำหรับใช้ในการฟื้นฟูสภาวะเสื่อม นอกจากนี้ ทางคณะผู้วิจัยได้มีการพัฒนาแบบจำลองทางเภสัชจลนศาสตร์ของระบบนำส่งยาที่ถูกฉีดเข้าในข้อเพื่อใช้ในการพยากรณ์ความเข้มข้นของยาที่มุ่งเป้าประสงค์ไปยัง Mesenchyme Stem Cells (MSCs) โดยใช้โปรแกรม ADMET PredictorTM ศึกษาคุณสมบัติทางกายภาพและเคมีของ AG โดยการพยากรณ์จากโครงสร้างเคมี จากนั้นพัฒนาและทดสอบแบบจำลองของตำรับยาเมื่อฉีดเข้าในข้อเข่า โดยใช้โปรแกรม GastroPlus® 9.8.2 ซึ่งเป็นโปรแกรมเภสัชจลนศาสตร์บนฐานสรีรวิทยา (physiologically-based pharmacokinetics (PBPK) model) เพื่อพยากรณ์ AG ในข้อเข่าและกระแสเลือด ผู้วิจัยใช้รูปแบบตำรับยาน้ำใสที่มีปริมาณของ AG ขนาด 0.1, 1, 5 และ 10 มิลลิกรัม ทำให้สามารถพยากรณ์ปริมาณของ AG ในชั้นต่างๆ ของข้อเข่าที่ synovial fluid, plasma, cartilage, intimal, subintimal และ lymph node โดยที่ปริมาณของ AG ที่อยู่ในส่วนต่างๆ คือ ปริมาณของยา AG ที่สามารถละลายได้ทั้งหมดใน synovial fluid เนื่องจากยาที่ฉีดเข้าไปในข้อเข่าเป็นรูปแบบตำรับยาน้ำใส และจากการพยากรณ์ พบว่า ไม่มีการตกตะกอน การลดลงของ AG ในหนูทดลอง มนุษย์ปกติ และมนุษย์ที่เป็นโรคข้ออักเสบรูมาตอยด์นั้นเป็นปฏิกิริยาอันดับหนึ่ง (first order) แต่จะพบว่า ในหนูทดลองมีความสามารถในการกำจัดยาได้ช้าที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับมนุษย์ปกติและมนุษย์ที่เป็นโรคข้ออักเสบรูมาตอยด์ ในมนุษย์ปกติจะมีความสามารถในการกำจัดยาได้ดีกว่ามนุษย์ที่เป็นโรคข้ออักเสบรูมาตอยด์ ทำให้ในมนุษย์ปกตินั้นมีปริมาณของ AG ลดลงได้รวดเร็วกว่ามนุษย์ที่เป็นโรคข้ออักเสบรูมาตอยด์ และจากการพยากรณ์ พบว่า จะมี AG ในรูปอิสระประมาณร้อยละ 30 ที่อยู่ใน synovial fluid และ AG ไม่สามารถเข้า lymph node ได้ เนื่องจากการศึกษานี้ยังไม่มีการพัฒนาแบบจำลองของ AG ในรูปแบบระบบนำส่งซึ่งอาจจะสามารถเข้าสู่ lymph node ได้ด้วย และระบบนำส่งของ AG จะมีความจำเพาะเจาะจงที่จะมุ่งเป้าประสงค์ไปยัง MSCs ที่อยู่ที่ข้อเข่า ซึ่งทำให้พฤติกรรมทางเภสัชจลนศาสตร์ของ AG ไม่เหมือนยาโมเลกุลขนาดเล็กทั่วไป ซึ่งสามารถ simulation ได้โดยการใช้ทฤษฎีของ Target-mediated drug disposition (TMDD) model คณะผู้วิจัยจึงได้มีการพัฒนาแบบจำลองขึ้นมาโดยใช้โปรแกรม Berkeley Madonna และประสบความสำเร็จในการพัฒนาแบบจำลองดังกล่าว
บทคัดย่อ
The aim of this research was to characterize and evaluate the innovative effects of the Thai herbal extract, Andrographolide (AG), on the human suprapatellar fat pad (SPFP) in the osteoarthritis (OA) patients and also develop and optimize the formulation of AG using Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) nanocarriers and gelatin-based hydrogel. Suprapatellar fat pad adipose-derived stem cells (SPFP-ASCs) were isolated by enzymatic digestion, cultured and analyzed by light microscopy to observe morphology and growtAh. The cells treated with AG or without AG were characterized in vitro by immunophenotype, gene expression, and ability to differentiate into multilineage potential to be further differentiated into the osteogenic, adipogenic and chondrogenic cells under the appropriate inductions. The medium SPFP-MSCs cells showed uniform morphology and good proliferation. They expressed CD29, CD73, and CD105 but were negative for CD34 and CD45. Multilineage potential became positive for Alizarin Red S, Oil Red O, Toluidine Blue, and Alcian Blue staining while the effect of AG revealed that AG had no cytotoxic effects when the concentration was less than 12.5 μg/mL. Interestingly, AG had significantly enhanced osteogenesis and chondrogenesis as evidenced by a the significantly intensified stain for Alizarin Red S, Toluidine Blue and Alcian Blue. Moreover, AG can upregulate the expression of genes related to osteogenic and chondrogenic differentiation, including Runt-related transcription factor 2 (Runx2), Osteopontin (OPN), SRYBox Transcription Factor 9 (Sox9), and Aggrecan. In contrast, AG suppressed adipogenic differentiation as evidenced by significantly diminished Oil Red O staining and the expression levels for adipogenic-specific genes for Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma 2 (PPAR-γ2) and Lipoprotein lipase (LPL). For these therapeutic properties, AG was successfully prepared the nanoparticles by the single emulsion solvent evaporation method and incorporated with gelatin-based hydrogel. The results of in vitro release patterns showed that the AG significantly delayed the AG release more than 1 month when combined with gelatinbased hydrogel and successfully displayed a long term sustained release almost 2 months for implantation and over 2 months for injection providing a novel strategy for the local management of osteoarthritis disease. Therefore, AG has great potential as the therapeutic agent derived from natural sources for regenerative medicine. Furthermore, this research aims to develop a pharmacokinetic model of an intra-articular drug delivery system for predicting drug concentrations targeted to mesenchyme stem cells. Using ADMET PredictorTM program, the physical and chemical properties of AG were predicted from the chemical structure. Then we develop and test a model of the formulation when injected into the knee joint. By using GastroPlus® 9.8.2 program and using the formulation as 0.1, 1, 5, and 10 mg solution, the amount of AG was predicted at the synovial fluid, plasma, cartilage, intimal, subintimal and lymph node. The amount of AG in different layers is the dosage of the AG that can be completely dissolved since the drug is injected into the knee joint as a clear liquid formulation. And from the prediction, it was found that there was no precipitation. The elimination of AG in rats, normal humans, and humans with rheumatoid arthritis is a first-order reaction. The elimination of AG in rats is the slowest when comparing with that in normal humans and humans with rheumatoid arthritis. In normal humans, AG can be eliminated better than in humans with rheumatoid arthritis so elimination time of AG in normal humans is shorter than humans with rheumatoid arthritis. Moreover, it was predicted that approximate 30% of the AG in the synovial fluid is in free form and the AG was not able to enter the lymph node. Since this study has not yet developed a model of AG as a delivery system that may also be able to enter the lymph node. In addition, for delivery system, AG can be specifically targeted to the MSCs located at the knee joint. Unlike conventional AG small molecule drugs, the pharmacokinetics of AG delivery system can be simulated using the theory of Target-mediated drug disposition (TMDD) model. We have successfully developed this model using Berkeley Madonna program as well in this study.
